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目的：构建MC3T3-E1细胞增殖期、基质分泌期、矿化期三个阶段甲基化表达差异谱并进行初步分析。验证甲基化芯片结果,探讨DNA甲基化对基因mRNA表达的影响,以及去甲基干预后基因mRNA表达情况的变化。方法：MC3T3-E1细胞使用含抗坏血酸和p-甘油磷酸钠(β-GP)的培基培养,分别在细胞培养的0天、10天、24天抽提RNA做逆转录,real-time PCR观察Ⅰ型胶原、骨钙素、骨桥蛋白、ALPmRNA表达情况。观察细胞形态变化,并行矿化结节染色。分别抽取培养0天、10天、24天的MC3T3-E1细胞gDNA,进行甲基化芯片杂交,获得三个不同分化阶段的DNA甲基化谱。挑选出细胞增殖期、基质分泌期、矿化期三个阶段高甲基化或低甲基化基因,获得DNA甲基化水平存在差异的基因分组。对差异基因进行染色体分布分析以及染色体定位,使用DAVID在线软件分别对各个分化阶段甲基化状态不同的基因进行功能分类。使用MassARRAY DNA甲基化定量分析技术对甲基化芯片中有差异的若干个基因进行验证。对部分基因进行real-time PCR,检测DNA甲基化对基因mRNA表达的影响。使用去甲基化药物RG108干预细胞后再进行MTT试验以及real-time PCR,与对照组相比较观察DNA甲基化水平改变对细胞增殖和基因mRNA表达情况的影响。结果：1.使用含抗坏血酸和β-GP的诱导培基培养MC3T3-E1细胞,]eal-timePCR显示Ⅰ型胶原mRNA在培养24天时较培养0天和10天表达量有显著增加；ALP培养第10天表达量最高；骨钙素、骨桥蛋白mRNA表达随着培养时间增加递增明显。细胞形态观察显示诱导培基培养0天时MC3T3-E1细胞形态近似梭形；培养10天时MC3T3-E1细胞近似“铺石路”样改变；培养22天时MC3T3-E1细胞重叠生长,并自发形成汇聚的细胞团,培养24天,Von Kossa染色可见典型矿化结节产生。根据ALP、骨钙素、骨桥蛋白等基因表达的变化将MC3T3-E1细胞的分化分为细胞增殖期(0天)、基质分泌期(10天)、矿化期(24天)三个阶段；2.提取诱导培基培养0天、10天、24天的MC3T3-E1细胞gDNA,进行甲基化芯片杂交。获得三个不同分化阶段的DNA甲基化谱。增殖期高甲基化基因50个,低甲基化基因93个,基质分泌期高甲基化基因96个,低甲基化基因43个,矿化期高甲基化基因52个,低甲基化基因147个。这些差异甲基化基因主要涉及程序性细胞死亡、转录调控、代谢、转运以及信号转导等广泛的生物学过程。MassARRAY DNA甲基化定量分析结果与甲基化芯片结果吻合。基因启动子区域DNA甲基化抑制Camk1d, Bmpr1b, Fbln7, Itga3, Pias2, Pcdha12, Mdm4, Tmem54 mRNA的表达,去甲基化药物RG108可促进细胞增殖,干预细胞后,DNA高甲基化基因mRNA表达明显增高。结论：培养0天、10天、24天的MC3T3-E1细胞可以代表其增殖期、基质分泌期、矿化期三个阶段。对此三个阶段细胞进行gDNA甲基化芯片杂交,获得了三个不同分化阶段的DNA甲基化谱。差异甲基化基因涉及广泛的生物学过程。基因启动子区域DNA甲基化负性调控成骨相关基因表达,去甲基化药物RG108可促进细胞增殖,促进DNA高甲基化基因的表达。目的：Taurine广泛分布于哺乳动物血浆以及组织中,是哺乳动物体内中最重要的游离beta-氨基酸。我们之前的研究发现Taurine可抑制破骨细胞的分化,但具体机制尚不十分清楚。本研究以成骨细胞与前破骨细胞共培养模型为研究对象,旨在探讨Taurine是否通过影响成骨细胞OPG与RANKL的表达来抑制破骨细胞的分化。方法：利用24小时内新生小鼠颅骨和6-8周龄小鼠四肢长骨分别分离,获得成骨细胞和骨髓细胞,将成骨细胞与骨髓细胞进行共培养,同时给予不同浓度Taurine干预。共培养6天后进行破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)染色鉴定。同时采用real-time PCR检测Taurine对成骨细胞OPG和RANKL表达的影响。结果：Taurine可抑制成骨细胞／骨髓细胞共培养诱导的破骨细胞分化,且与浓度相关。然而Taurine不影响成骨细胞OPG和RANKL的表达。结论：Taurine可浓度依赖性抑制成骨细胞／骨髓细胞共培养诱导的破骨细胞分化,此作用与成骨细胞OPG和RANKL的表达无关。目的：我们之前的研究发现单核细胞系RAW264.7诱导的破骨细胞表达功能性TAUT (taurine transporter),并且Taurine可抑制其分化。但二者之间是否相关尚不清楚,在其他来源的破骨细胞的情况也尚不了解。本研究旨在探讨M-CSF和RANKL诱导骨髓来源巨噬细胞所获得的破骨细胞是否同样表达TAUT,其分化是否也可被Taurine抑制,进一步阻断TAUT后Taurine对破骨细胞的作用是否仍存在。方法：利用M-CSF和RANKL诱导骨髓来源巨噬细胞获得破骨细胞同时予不同浓度Taurine干预,TRACP染色计数破骨细胞鉴定分化情况。提取骨髓巨噬细胞来源破骨细胞的RNA,进行RT-PCR,检测TAUT mRNA在破骨细胞的表达情况。使用免疫细胞化学方法检测TAUT蛋白的表达。TAUT siRNA干扰RAW264.7细胞,Western blot检测干扰后TAUT蛋白合成的情况。同时[3H]taurine摄取实验评估干扰后TAUT蛋白的功能。予Taurine干预TAUTsiRNA干扰组和对照组,TRACP染色并计数破骨细胞再次检测Taurine对破骨细胞分化的作用。结果：M-CSF和RANKL诱导骨髓来源巨噬细胞获得破骨细胞中,有TAUT mRNA以及TAUT蛋白的表达。Taurine干预可显著抑制该来源破骨细胞的分化。siRNA干扰TAUT后,TAUT蛋白表达及功能均明显下降,并且Taurine失去对破骨细胞分化的抑制作用。结论：M-CSF、RANKL诱导骨髓来源巨噬细胞获得的破骨细胞有功能性TAUT表达,Taurine可抑制其分化。阻断TAUT表达后,Taurine失去对破骨细胞分化的抑制作用。