在生物体内存在可催化多步连续反应的通用酶,对生物代谢过程具有重要作用。八氢番茄红素脱氢酶CrtI作为典型代表,可以催化多步连续脱氢反应,生成番茄红素等具有重要价值的产物。本文主要探索调控CrtI多步脱氢功能的关键位点及其相关结构的进化规律。本研究以催化四步脱氢反应的三孢布拉霉(Blakeslea trispora)来源的CrtI(BtCrtI)为研究对象。首先,通过理性设计,探索催化活性位点的结构对BtCrtI催化功能性的影响,结果显示已找的酶活性中心的结构位点(Y196、N474、SSS311/312/313位点)变化只改变了酶的催化活性,而无法调控脱氢步数。据此推断,活性中心结构的改变不直接影响其多步催化功能。随后,通过易错PCR的非理性手段,找到了调控CrtI脱氢步数的若干关键突变位点(H136和H453),CrtI突变体H136R显著影响了脱氢产物的比例,四步脱氢产物番茄红素与三步脱氢产物链孢红素的比例由15.7:1降至3.4:1;而CrtI突变体H453R将脱氢步数由四步变为两步,终产物由番茄红素变为ζ-胡萝卜素。通过CrtI结构模型分析显示,H136与H453远离酶的活性中心,推断该非活性中心位点对调控脱氢步数起到关键作用。进一步对这两个位点进行突变研究,发现CrtI突变体H136A的番茄红素产量比野生型提高了约30%,番茄红素与链孢红素比例也提高至25:1,加大了脱氢程度。通过比较CrtI及其突变体的表达差异发现,突变体具有与野生型相当的表达水平,因此,突变体中的结构变化是决定其脱氢步数变化的关键因素。最后,对多来源八氢番茄红素脱氢酶建立进化树并聚类分析,探索该酶的生物进化规律,并利用CrtI同工酶进行序列比对,发现H136与H453位点对应的氨基酸残基具有规律性的序列进化特征,表现出特有的催化脱氢步数调控功能,而且其结构进化的规律性已通过我们的实验研究结果得以验证,进一步表明H136与H453位点在酶的结构进化中,是调控脱氢步数的关键结构位点。本研究探索了调控多步脱氢酶CrtI脱氢步数的关键结构位点,并从酶进化角度分析了这类结构位点的进化规律和功能特性,为酶进化理论提供新内容,为研究酶催化多步连续反应机制提供新思路。