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研究背景和目的瘙痒是机体的一种防御保护机制,急性瘙痒可通过搔抓反应来去除对机体有害的物质。然而,长期持续性的慢性瘙痒却给患者带来极大的痛苦,不仅给社会和家庭增加巨大的经济负担和压力,也严重影响患者的生活质量。而临床上常规的抗组胺药物对大多数的慢性瘙痒无效或效果甚微,因此,对慢性瘙痒机制及其新型药物的研究是亟待解决的问题。慢性过敏性接触性皮炎（Allergic contact dermatitis,ACD）是一种早期以皮肤红肿、丘疹和水泡为主要特征并逐渐转化成鳞屑和疤痕的慢性皮肤疾病。在既往的研究中,ACD是以Th2免疫反应为主的炎症性皮肤疾病,其Th2型细胞因子包括白细胞介素（Interleukin,IL）-4、IL-5、IL-13和胸腺基质淋巴细胞生成素（Thymic stromal lymphopoietin,TSLP）在受累皮肤组织中明显升高,血清中免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）E的产生显著增加以及受累皮肤组织中活化肥大细胞和嗜酸性粒细胞数量增多。同时,背根神经节中瞬时受体电位锚蛋白1（Transient receptor potential ankyrin 1,TRPA1）和瞬时受体电位香草酸1（Transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1）在慢性疼痛和瘙痒的发生发展中起着至关重要的作用。NLRP3（NOD-,LRR-and pyrin domain-containing protein 3）作为最受关注的核苷酸结合寡聚化结构域（Nucleotide-binding oligomerization domain,NOD）样受体（NOD like receptor,NLR）,在许多炎症性疾病包括自身免疫相关的皮肤疾病中起到很重要的作用,例如痤疮、真菌感染、银屑病等。在许多小鼠模型的研究中发现,针对NLR的治疗可以减轻过敏性疾病如特异性皮炎、过敏性接触性皮炎和过敏性哮喘的症状,这说明NLR具有成为治疗人类慢性过敏性疾病靶标的潜力。而NLRP3炎症小体是在过敏性炎症性的ACD中的作用尚未见研究报道。本研究将使用NLRP3基因敲除小鼠来阐明NLRP3炎症小体在ACD引起的慢性瘙痒中的作用,期望为慢性瘙痒治疗新靶点的发现提供依据。实验方法:本研究使用8周龄的C57BL/6J野生型（wide type,WT）、NLRP3基因敲除（NLRP3knockout,NLRP3-/-）和caspase1/11基因敲除（CASP1/11 knockout,CASP1/11-/-）雄性小鼠;选择氯喹（Chloroquine,CQ）、组胺（Histamine,His）、五羟色胺（Serotonin,5-HT）、化合物48/80（Compound 48/80,Comp 48/80）、SLIGRL-NH2多肽和内皮素1（Endothelin-1,ET-1）进行颈部皮下注射,神经胺B（Neuromedin B,NMB）和胃泌素释放肽（Gastrin-releasing peptide,GRP）进行鞘内注射来建立急性瘙痒模型;用半抗原化学药物2,4-二硝基氟苯（1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene,DNFB）涂抹小鼠腹部和后颈部皮肤建立过敏性接触性皮炎ACD慢性瘙痒动物模型,腹腔注射NLRP3炎症小体特异性抑制剂MCC950来抑制炎症小体的活性。用实时荧光定量PCR检测相应分子的转录水平,用western blot、免疫组化检测皮肤组织中NLRP3、caspase1切割片段p20和IL-18的表达水平,用ELISA检测血清中Ig E和皮肤组织中成熟IL-1β和IL-4的水平;免疫荧光方法检测皮肤组织中肥大细胞数量以及NLRP3和IL-1β的亚细胞定位;免疫荧光法检测背根神经节中IL-4R和TRPA1的水平及其亚细胞定位。实验结果:1.qPCR和WB、IHC及ELISA结果显示,在DNFB建立慢性瘙痒小鼠皮肤组织中NLRP3、caspase1、成熟IL-1β和IL-18的表达量明显增高。2.在His、5-HT、Comp 48/80诱导急性瘙痒中,NLRP3-/-小鼠挠痒次数明显高于WT小鼠,而CQ、SLIGRL、ET-1、NMB和GRP诱导的急性瘙痒次数两组没有显著的差异。3.在DNFB诱导的ACD慢性瘙痒中,NLRP3-/-较WT小鼠的瘙痒次数显著增多。4.在建立ACD模型的小鼠中:NLRP3-/-小鼠皮肤组织中肥大细胞数量明显增多,皮肤表皮厚度变薄且血清Ig E含量稍增高;皮肤中IL-4和TSLP的表达水平比WT小鼠明显升高;背根神经节中TRPA1的水平显著升高而TRPV1不受影响。5.CASP1/11-/-小鼠在DNFB的诱导下瘙痒次数和血清Ig E水平较WT小鼠显著增加,但表皮厚度和真皮层浸润肥大细胞数量与WT小鼠无明显差异。CASP1/11-/-小鼠皮肤组织中IL-4和TSLP的m RNA水平显著下降,蛋白水平无明显差异。6.在DNFB诱导的ACD小鼠中应用MCC950可降低血清中Ig E的水平,但其对瘙痒次数、肥大细胞数量和表皮厚度无影响。7.免疫荧光共定位的结果显示绝大部分IL-4R+表达细胞是TRPA1阳性的神经元。结论:1.NLRP3炎症小体在DNFB诱导的ACD慢性瘙痒小鼠的皮肤组织中明显被活化。2.NLRP3的缺失可加重外周组胺依赖药物引起的急性瘙痒,而对于组胺非依赖的药物以及中枢瘙痒介质NMB和GRP引起的急性瘙痒没有影响。3.NLRP3的缺失可加重DNFB诱导的ACD慢性瘙痒,其机制与皮肤中IL-4和TSLP表达上调,背根神经节中TRPA1的含量明显升高有关。4.NLRP3炎症小体特异性抑制剂MCC950不能影响慢性瘙痒严重程度;而CASP1/11基因敲除以IL-4和TSLP以外的机制加重慢性瘙痒。5.NLRP3基因敲除加重过敏性接触性皮炎慢性瘙痒,其机制是通过上调皮肤中IL-4和TSLP水平以及增加背根神经节中TRPA1活性来加剧瘙痒,而此机制不通过炎症小体活性来实现。