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禽呼肠孤病毒(ARV)是番鸭“肝白点病或花肝病”的病原,病毒基因组含有10个双股RNA片段,分为L、M和S三组,其中S组4个小基因节段是研究ARV遗传演化的关键,已发现ARV分离株S组基因具有两种基因型:一种基因型的代表株为DRV-89026和DRV-89330(禽(番鸭)呼肠孤病毒YB株为此基因型),另一种基因型的代表株为ARV-S1133(禽(番鸭)呼肠孤病毒YJL株为此基因型)。在禽呼肠孤病毒中存在基因重组(配)的现象,即当两个有亲缘关系但生物学性状不同的毒株同时感染细胞时,可产生发生基因片段交换的子代病毒。与亲本毒株相比,产生的子代重组(配)毒株的生物学性状可能发生改变,或子代病毒对其宿主的致病力与亲本病毒存在差异,甚至由于基因重组(配)可能产生新的血清型。本试验通过模拟自然感染情况下,利用本实验室保存的两株禽(番鸭)呼肠孤病毒(YB和YJL)同时感染细胞,获得发生基因片段重组的子代病毒后,研究其生物学性状的改变以及在致病性上与亲本株病毒的差异。首先,蚀斑法纯化亲本毒株。其次,从Genebank上读取法国分离株DRV-89026和DRV-89330,美国分离株ARV-S1133和176,以及我国分离株S14的S组基因节段编码的σC,σNS,σB,σA四个蛋白的核苷酸序列设计8对引物,分别建立含有两亲本株S组四条基因片段的多重RT-PCR检测方法。再次,两亲本毒株共同感染禽胚成纤维细胞后,根据蚀斑形状、大小等培养性状的不同,挑取可能为重组子代的病毒蚀斑,分别用两亲本毒株的多重RT-PCR方法检测,获得发生基因片段重组的子代病毒。最后,将亲本毒株与重组(配)子代病毒分别接种禽胚成纤维细胞、禽胚卵黄囊、一日龄雏鸡和雏番鸭爪垫,研究重组(配)子代病毒生物学性状的改变以及其对宿主在致病性方面与亲本毒株的差异。通过本实验得出的结果有:⑴禽(番鸭)呼肠孤病毒在禽胚成纤维细胞上形成圆形,边缘较整齐的蚀斑,经中性红染色可见白色空斑。⑵禽胚死亡时间的差异:鸡胚死亡时间:YB,9d-14d;YJL,65-71h;重组(配)子代Ⅰ,56-61h;重组(配)子代Ⅱ,7d-10d。番鸭胚死亡时间:YB,134-229h;YJL,90-95h;重组(配)子代Ⅰ,66-76h;重组(配)子代Ⅱ,93-117h。⑶死亡胚体出血情况的差异:重组(配)子代Ⅰ>YJL>重组(配)子代Ⅱ>YB。⑷一日龄雏鸡和雏番鸭爪垫接种病毒死亡剖检后,病变组织的差异:重组(配)子代与亲本毒株相比较,病变部位较多,相同组织发生病变情况较严重。亲本毒株接种雏鸡和雏番鸭后,主要病变集中于肝脏和脾脏;而重组子代病毒接种雏鸡和雏番鸭后,病变除肝脏和脾脏外,还可见胰腺有出血点,胸腺出血,卵黄吸收不良等。⑸重组子代毒株与亲本株TCID50的测定结果:YB,10-6.5;YJL,10-7.24;重配子代Ⅰ,10-7.77;重配子代Ⅱ,10-7.53。⑹病理切片结果显示:重组子代毒株较亲本毒株而言,各组织内出现较多坏死灶,细胞严重变性坏死,淋巴组织内淋巴细胞减少,对各组织及细胞造成更为严重的破坏。⑺经软件分析后可知,禽呼肠孤病毒两亲本株YB与YJLσA蛋白的氨基酸序列同源性为88%;σB蛋白的氨基酸序列同源性为61%。⑻禽(番鸭)呼肠孤病毒两亲本株YB和YJLσA蛋白的二级结构以及亲水性和疏水性差异较小;σB蛋白的二级结构差异较大,尤其是在氨基酸的第90-200位之间。由结果可知:⑴经本实验证明,当两种禽(番鸭)呼肠孤病毒(YB和YJL)同时感染禽胚成纤维细胞时,会出现基因重组(基因重配)的现象。⑵由实验结果可得出,重组子代病毒的生物学特性有所改变,包括其在禽胚成纤维细胞上形成蚀斑的能力、对禽胚的致病力(禽胚死亡时间、死亡胚体出血情况)以及爪垫接种感染一日龄雏鸡和雏番鸭后发生病变的器官和组织等。并且重组子代病毒较亲本病毒而言,宿主对其易感性更高。⑶经本实验证明,对于同一种细胞(禽胚成纤维细胞),禽(番鸭)呼肠孤病毒形成蚀斑的能力与病毒的感染力有关。⑷结合σA和σB蛋白二级结构分析与重组子代与亲代之间对宿主致病性的差异可见,病毒蛋白的空间结构对病毒毒力的发挥有重要作用。当发生基因重组后,子代病毒蛋白空间结构差异越大,对其毒力或致病性影响越大。