论文部分内容阅读
扩展青霉(Pennicilum expansum)及其水溶性代谢产物展青霉素(patulin, PAT)是导致苹果采后腐烂及苹果制品污染的重要因素。为减少由感染P. expansum所致的苹果采后腐烂并提高贮藏期间的果实品质,本研究采用原位筛选、N+注入诱变技术选育出一株可高效抑制P. expansum的菌株BA-16-8,并以该菌为试材,分别对其抑菌活性、去除PAT能力、抗菌物质的鉴定、抗菌机制、作为生物活性膜对苹果采后的防腐保鲜及生物安全性进行了深入研究,得到如下结论。从苹果表面原位分离出可有效抑制P. expansum的菌株BA-16,经形态学、AP150CH鉴定和16S rDNA系统发育等分析,该菌株被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。以N+注入技术对其进行诱变选育,获得抗菌性能强且遗传性能稳定的突变株B. amyloliquefaciens BA-16-8.经检测,该菌株的菌悬液及无细胞发酵液可抑制P. expansum的生长及PAT的分泌量。为明确菌株B. amyloliquefaciens BA-16-8拮抗P. expansum的关键物质,采用PCR技术对菌株基因组进行脂肽抗生素合成相关基因检测；采用高效液相色谱对菌株发酵液中的脂肽类抗生素进行分离和纯化；采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定脂肽结构。鉴定结果显示该菌株可产脂肽类抗生素surfactin和fengycin。经抑菌实验和基因敲除实验,失去了fengycin合成能力的突变株B. amyloliquefaciens BA-16-8-△fen对P.expansum的拮抗效果显著降低,从而确定抑制P. expansum的关键物质为fengycin 。为探究fengycin对P. expansum的具体抑制机制,采用扫描电镜、透射电镜、核酸染色、荧光显微观察和凝胶阻滞等技术从细胞层面分析fengycin的抑菌机制；采用呼吸作用检测、线粒体复合酶活性检测等实验从生理生化层面探究fengycin处理P. expansum代谢所产生的影响。结果发现fengycin不仅可改变P. expansum细胞膜的通透性、破坏线粒体等细胞器结构,还可通过结合P. expansum线粒体复合酶II和IⅡ的相关基因,抑制其表达,使线粒体酶的活性下降,呼吸及代谢受到阻碍。为研究fengycin对P. expansum合成PAT的影响,采用实时荧光定量PCR的方法考察fengycin处理下PAT合成关键基因6-MSAS和IDH的表达情况。结果表明, fengycin处理可通过下调6-MSAS基因的转录从而抑制P. expansum对PAT的合成。为确保拮抗菌B. amyloliquefaciens BA-16-8在苹果防腐保鲜应用中的安全性,对其进行了28 d喂养实验和急性经口毒性实验等安全性评估。结果表明, B. amyloliquefaciensBA-16-8菌悬液(1×108CFU/mL)对小鼠无不良影响,具备安全性。以腐烂率为评价指标,分别确定拮抗菌菌悬液和壳聚糖的最佳浓度及配比,并将其制成防腐抗菌复合膜。结果显示：与对照组相比,2%的壳聚糖溶液与108CFU/mL的B. amyloliquefaciens BA-16-8菌悬液等比例复配制成的生物活性膜具有显著的防腐效果。以苹果多酚含量为评价指标,确定水杨酸、氯化钙、茉莉酸甲酯的最佳浓度及配比,并将其制成保鲜液。结果表明：与对照组相比,由200 μg/mL的水杨酸、2%的氯化钙和0.05 μmol/mL的茉莉酸甲酯等比例复配制成的混合液具有良好的保鲜效果。以红富士苹果为实验材料,对其分别进行涂膜处理并贮藏。结果表明：与对照组相比,由拮抗菌菌悬液、壳聚糖、水杨酸、氯化钙和茉莉酸甲酯按照等比例复配制成的生物活性膜可有效降低苹果的失重率和腐烂率,并可较好地保持果实硬度,延缓Vc、可溶性固形物和可滴定酸含量的下降以及丙二醛的上升,防腐和保鲜效果显著。综上,B. amyloliquefaciens BA-16-8产生的fengycin可通过改变胞膜通透性、破坏细胞结构、与DNA结合影响线粒体复合酶活性、抑制呼吸及代谢和下调PAT合成基因的表达等方式有效抑制P. expansum的生长及产毒,将其用于苹果采后的涂膜处理,展现出良好的防腐保鲜效果。