【摘 要】
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橙花醇属于单萜化合物,乙酸橙花酯是其乙酯衍生物,两者均作为香料在食品、日化中应用广泛,此外还表现出多种生理活性。化学合成法是橙花醇和乙酸橙花酯主要的工业合成方法,但化学合成中存在能量消耗大,副产物多,污染环境等问题,因此开发出产物单一,过程温和易于控制,绿色可持续的生物合成法具有积极的意义。本研究利用代谢工程手段在大肠杆菌中构建橙花醇和乙酸橙花酯合成途径,首次实现了两者的微生物从头合成,并进一步对
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橙花醇属于单萜化合物,乙酸橙花酯是其乙酯衍生物,两者均作为香料在食品、日化中应用广泛,此外还表现出多种生理活性。化学合成法是橙花醇和乙酸橙花酯主要的工业合成方法,但化学合成中存在能量消耗大,副产物多,污染环境等问题,因此开发出产物单一,过程温和易于控制,绿色可持续的生物合成法具有积极的意义。本研究利用代谢工程手段在大肠杆菌中构建橙花醇和乙酸橙花酯合成途径,首次实现了两者的微生物从头合成,并进一步对产量的提高进行探究。首先通过引入番茄橙花基焦磷酸合成酶t NDPS1和大豆橙花醇合酶Gm NES,构建橙花醇合成途径,使工程菌株LZ001生产得到0.053±0.015 mg/L橙花醇,随后通过引入酿酒酵母的MVA途径提高前体供应,构建工程菌株LZ003,使橙花醇产量提高至0.547±0.024 mg/L。进一步通过过表达内源或者酿酒酵母乙酰辅酶A酰基转移酶,构建菌株LZ004和LZ005,通过比较,过表达酿酒酵母乙酰辅酶A酰基转移酶的工程菌株LZ005的橙花醇产量更高,达到1.564±0.102 mg/L。在橙花醇工程菌株LZ005的基础上通过引入酿酒酵母的乙醇酰基转移酶ATF1,成功实现乙酸橙花酯的合成,使工程菌株LZ006的乙酸橙花酯产量达到0.250±0.014 mg/L。随后通过过表达MVA途径限速酶t HMG1和外源添加丙酮酸,使工程菌株LZ007在添加2 g/L丙酮酸的条件下,乙酸橙花酯产量提高至11.712±0.653 mg/L,与LZ006相比提高45.8倍。橙花醇作为乙酸橙花酯前体,是限制乙酸橙花酯产量提高的关键因素之一,通过质粒拷贝数优化的方式对MVA途径进行再平衡,进一步提高橙花醇产量。首先过表达MVA途径限速酶t HMG1构建工程菌株LZ008,橙花醇产量从1.564±0.102 mg/L提高至6.904±0.153 mg/L。随后将质粒p BBR1MCS上的MVA途径上半部分（ERG10、ERG13、t HMG1）整体移至高拷贝质粒p ET28a,提高MVA途径上半部分整体的表达,使得菌株LZ009的橙花醇产量提高至10.179±0.639mg/L。但检测到MVA的积累,为了减少其积累,进一步在p ET28a中过表达MVA途径下半部分中的ERG12,结果菌株LZ010中甲羟戊酸积累减少,同时橙花醇产量进一步提高至12.431±0.605 mg/L。最后通过添加5 g/L酵母提取物改善菌体生长,使LZ010的橙花醇产量达到15.303±0.201 mg/L,是初始菌株LZ001产量的288.7倍。利用代谢工程手段,本研究首次实现橙花醇和乙酸橙花酯在微生物中的从头合成,并对产量做了进一步的优化,为实现食品香料橙花醇和乙酸橙花酯的工业化生物合成提供参考。
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