目的:1.从经络角度研究鼻咽癌患者虚实特征,探讨气虚在鼻咽癌的脏腑表现特点,对中医气虚癌变理论进行验证,为鼻咽癌临床中医药防治提供理论指导。2.利用芯片技术分析气虚质与鼻咽癌的microRNA表达特征,从分子生物学层面对气虚功能表现的微观物质基础进行初步探讨。3.通过体外流式细胞学及细胞侵袭实验,探讨气虚质与鼻咽癌特征性microRNA在体外细胞的恶性潜质,为鼻咽癌气虚癌变机制的深入研究奠定理论基础。方法:1.取2014年11月到2016年6月中山市中医院57例鼻咽癌自然态患者为研究对象。首先,采用调查量表形式对鼻咽癌患者体质类型分布进行调查,同时通过经络检测仪对鼻咽癌经络虚实特征进行分析,综合鼻咽癌患者体质特点与经络诊断结果,验证经络检测仪在临床体质类型诊断的准确性。其后,取同期217例健康体检者作为对照组,通过经络检测仪分析其与鼻咽癌患者的经络虚实差异,从而探讨鼻咽癌患者虚实特征。最后,对2014年5月到2016年11月中山市中医院保健中心1126例岭南健康人群与137例非岭南健康人群进行经络检测,探讨鼻咽癌高发岭南人群的虚实特征表现。2.在2014年5月到2015年10月中山市中医院门诊患者中,取鼻咽癌患者17例,包括气虚质8例及正常质9例;鼻咽炎患者12例,包括气虚质6例及正常质6例;作为研究对象。采用丹麦Exiqon的microRNA array芯片技术检测上述鼻咽组织microRNA表达,分析在气虚质与鼻咽癌中差异性表达的microRNA,并通过荧光定量PCR技术对特征性表达的microRNA进行验证。3.将基因芯片检测结果中,鼻咽癌与气虚质上调和下调表达差异倍数较高的microRNA分别进行沉默表达与过表达,并通过脂质体转染方法将其转染至HNE1鼻咽癌细胞中。采用流式细胞学检测相关microRNA转染后鼻咽癌细胞凋亡情况,并利用Transwell小室观察其转染后细胞侵袭能力。结果:1.经络检测结果(1)体质调查结果,57例鼻咽癌患者中正常体质有21例,占36.8%;含气虚体质患者19例,占33.3%;实证体质,包括失调体质与不含气虚质的复合体质在内共17例,占29.8%。57例鼻咽癌患者经络分布中,正常经络患者26例、虚证经络患者20例与实证经络患者11例,分别占45.6%、35.1%与19.3%。将患者经络诊断结果与体质调查结果逐一配对发现,经络检测仪诊断与临床体质调查在人体虚实诊断结果的吻合率为78.9%。通过配对资料McNemar卡方检验分析体质调查与经络检测在鼻咽癌异常率诊断的差异,以α =0.05水准,P=0.125>0.05。经络诊断仪在鼻咽癌患者体质异常率诊断的灵敏度为95.24%、特异度为96.77%、约登指数为0.92、假阳性率(误诊率)为16.67%、假阴性率(漏诊率)为4.76%。(2)鼻咽癌患者中超过一半以上的人群处于偏虚或偏实状态,其中虚证所占比例为35.10%,明显高于实证所占比例(19.3%)。鼻咽癌的虚证主要表现在脾、肾虚证,而实证表现为肝实,分别与健康人群相比,均存在显著统计学差异(P<0.05)。(3)岭南健康人群与非岭南地区健康人群经络总体异常率存在显著性差异(χ2=330.522,P=0 000),此差异主要体现于岭南健康人群虚证经络的比例明显高于非岭南地区健康人群(χ2=4.948,P=0.026)。2.芯片检测结果(1)microRNA在鼻咽癌以上调表达为主,上调幅度大,上调数量也多,上调2倍以上且具有统计学差异有90个,下调表达数量较少,下调2倍以上且具有统计学差异有24个。microRNA在气虚质也以上调表达为主,上调2倍以上且具有统计学差异的有34个,下调表达数量相对要少,下调2倍以上且具有统计学差异的有19个。综合分析microRNA在疾病及中医体质的差异表达时发现,microRNA在气虚质差异表达的幅度与数量相比于在鼻咽癌差异表达要小。在鼻咽癌及气虚质同时上调表达的且存在着统计学差异的microRNA有12个,在气虚质和鼻咽癌均明显下调的且存在着统计学差异的microRNA有8个。(2)对基因芯片研究结果中,对鼻咽癌与气虚质存在显著差异性且表达倍数较高的10个microRNA进行荧光定量PCR扩增,以验证其表达特征。其中包括在鼻咽癌呈上调表达的ebv-miR-BART4-5P,在鼻咽癌呈下调表达的hsa-miR-29c-5p,在气虚质中呈现上调表达的hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-122-3p,气虚质中呈现下调表达的hsa-miR-4715-5p、hsa-miR-4320,在鼻咽癌及气虚质中均呈上调表达的ebv-miR-BART1-3p、has-miR-18b-5p,在鼻咽癌及气虚质中均呈下调表达的hsa-miR-3127-3p、hsa-miR-4539。荧光定量PCR检测结果显示,在鼻咽癌组织表达存在明显差异的 microRNA 有 6 个,其中 hsa-miR-20a-5p、ebv-miR-BART4-5p、hsa-miR-18b-5p、ebv-miR-BART1-3p在鼻咽癌组织中明显上调表达(P<0.01),hsa-miR-29c-5p、hsa-miR-4539在鼻咽癌组织中明显下调表达(P<0.01),hsa-miR-20a-5p在气虚质中亦呈明显上调表达(t=4.542,P=0.000),上述microRNA扩增表达结果与芯片表达方向基本一致。3.细胞凋亡实验结果:(1)对基因芯片中呈高倍数上调表达的5个microRNA,通过抑制剂沉默表达并转染至HNE1细胞,结果显示,在鼻咽癌上调表达的ebv-miR-BART4-5P转染后的平均细胞凋亡率为25.40±8.60%;在气虚质上调表达的hsa-miR-122-3p与hsa-miR-20a-5p转染后的平均细胞凋亡率分别为29.90±10.94%与30.50±8.88%;在鼻咽癌及气虚质均呈上调表达的has-miR-18b-5p与ebv-miR-BART1-3p转染后的平均细胞凋亡率分别为24.20±6.98%与21.20±5.50%。上述5个上调表达的microRNA经抑制剂转染后HNE1细胞凋亡率均明显高于空白对照组(0.10±0.02%)与Inhibitor NC(11.10±2.27%),且组间差异显著(P=0.000)。(2)对基因芯片中呈高倍数下调表达的5个microRNA,通过模拟剂过表达并转染至HNE1细胞,结果显示,在鼻咽癌下调表达的hsa-miR-29c-5p转染后的平均细胞凋亡率为26.24±6.58%;气虚质下调表达的hsa-miR-4320与hsa-miR-4715-5p转染后的平均细胞凋亡率分别为25.30±5.50%与22.90± 11.07%;在鼻咽癌及气虚质均呈下调表达的hsa-miR-3127-3p与hsa-miR-4539转染后的平均细胞凋亡率分别为45.10±9.57%与31.80±6.98%。上述5个microRNA经模拟剂转染后,其HNE1平均细胞凋亡率均明显高于空白对照组(0.10±0.02%)与mimics NC(8.70±2.27%),且组间差异显著(P=0.000)。4.Transwell实验结果(1)对基因芯片中呈显著性上调表达的5个microRNA,通过抑制剂沉默表达并转染至HNE1细胞,结果显示,5个上调表达的microRNA经抑制剂转染后的HNE1细胞侵袭数均明显低于空白对照组(40.33±2.08)与抑制剂对照组(35.00±8.88),且组间差异显著(P<0.05)。在鼻咽癌及气虚质均呈上调表达的microRNA平均细胞侵袭数(23.00±8.27)明显高于仅在鼻咽癌上调表达的ebv-miR-BART4-5P细胞侵袭数(10.00±5.29),组间差异显著(P<0.05);而上述两组分别与仅在气虚质呈上调表达的microRNA平均细胞侵袭数(18.00±5.92)相比,组间未见统计学差异(P>0.05)。在上调表达microRNA中,气虚质相关的microRNA在细胞侵袭数上显示出明显恶性行为倾向,且鼻咽癌与气虚质均呈上调表达的microRNA所显示的恶性行为比仅在鼻咽癌上调表达的microRNA显著,推测气虚在鼻咽癌恶性行为的增强中起得重要作用。(2)对基因芯片中呈显著性下调表达的5个microRNA,通过模拟剂过表达并转染至HNE1细胞,结果显示,仅在鼻咽癌呈下调表达的hsa-miR-29c-5p在HNE1细胞中侵袭数为14.67±1.53;仅在气虚质中呈下调表达的hsa-miR-4320与hsa-miR-4715-5p平均细胞侵袭数为24.00±3.79;在鼻咽癌及气虚质均呈下调表达的hsa-miR-3127-3p与hsa-miR-4539的平均细胞侵袭数为31.50±2.43。经转染后的HNE1细胞侵袭数均明显低于空白对照组(40.33±2.08)与模拟剂对照组(52.33±12.74),且组间差异显著(P<0.05)。鼻咽癌及气虚质均呈下调表达的microRNA转染后的HNE1细胞侵袭数与仅在气虚质、仅在鼻咽癌相关microRNA在细胞侵袭数上呈递减趋势,且组间差异显著(P<0.05)。可见,下调表达microRNA经模拟转染过表达后均表现出一定抑癌能力,与鼻咽癌相关microRNA侵袭能力相比,气虚质相关microRNA抗癌能力明显减弱,并且气虚质及鼻咽癌相关microRNA表现出的抗癌能力弱化更为明显。结论:1.鼻咽癌患者及岭南人群气虚所占比例较高,考虑气虚为岭南人群高发鼻咽癌的重要因素,是鼻咽癌发生及进展的内因。2.气虚质和鼻咽癌均存在着特定的microRNA表达特征,气虚质特征性表达microRNA可能参与了鼻咽癌发生发展的功能表现。3.气虚质相关的microRNA影响鼻咽癌细胞凋亡与侵袭能力,其异常表达可能在鼻咽癌的恶性行为发挥重要作用。