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苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)是一种革兰氏阳性菌,在其芽孢形成过程中可以生成一种具有特异性杀虫活性的蛋白质伴孢晶体,即Bt蛋白。由于Bt蛋白杀虫活性频谱广,专一性强,在农业上常用于生物农药及抗虫转基因作物中。Bt蛋白能够通过转基因作物的残体、根系分泌物等途径进入到土壤中,造成其在土壤中的残留、富集,从而带来潜在的环境和生态风险。近年来,Bt蛋白在土壤中的残留问题已经得到广泛关注。如何高效、快速、专一性的提取、分离、纯化和检测Bt蛋白是实现土壤中Bt蛋白有效监控的重要因素。科学家们关于Bt蛋白-昆虫受体识别机理的研究为我们设计合成Bt蛋白分子识别材料提供了一种新的思路。考虑到Bt蛋白与昆虫中肠受体类钙粘蛋白作用时其主要的结合位点位于domain II的三个抗原表位loop 2、loop 3和loopct-8上,因此我们可以根据这三个抗原表位氨基酸序列的疏水性、亲水性和电荷性特点来设计合成聚合物纳米颗粒,使其对其中的一个或者多个抗原表位具有较强的亲和能力,最终用于整个Bt蛋白的特异性提取、分离和纯化。鉴于此,本课题采用自由基引发聚合法合成了一系列不同带电性能的聚合物纳米颗粒,通过条件优化筛选最佳聚合物纳米颗粒和最优孵育条件;比较聚合物纳米颗粒对其它具有相同、相似或者不同抗原表位的Bt蛋白,如Cry1Ac、Cry2A、Cry1C和Cry1F的结合能力;研究聚合物纳米颗粒对Bt Cry1Ab抗原表位domain II loop 2和昆虫受体类钙粘蛋白Bt-R1结合位点865NITIHITDTNNK876(NK-12)之间作用力的抑制情况。具体工作主要包括以下三个部分:(1)聚合物纳米颗粒与Bt Cry1Ab蛋白的结合能力研究:采用静态吸附法筛选出对Bt Cry1Ab蛋白亲和力最好的聚合物纳米颗粒为AAm18/AAc40(NP12),通过对其吸附条件,如pH、缓冲液浓度和盐浓度的优化,得到最佳吸附条件为:pH 6.0 10 mMPBS缓冲液。等温吸附实验结果表明,聚合物纳米颗粒AAm18/AAc40对Bt Cry1Ac蛋白的最大吸附容量为91 μg/g,达到平衡的时间约为40 min。(2)聚合物纳米颗粒对昆虫受体表位NK-12与Bt蛋白抗原表位RQ-12结合能力的抑制作用:比较体系(1)RQ-12/NK-12和体系(2)RQ-12+NP12/NK-12中剩余NK-12的量,结果发现体系2中剩余的NK-12明显高于体系1,表明,NP12的加入明显抑制了 RQ-12与NK-12之间的结合能力,其抑制率约为66.9%。该结果也在一定程度上证明NP12与昆虫受体类钙粘蛋白在分子识别机理上的相似性,其与Bt Cry1Ab蛋白的结合位点确实位于BtCry1Ab抗原表位domain Ⅱloop 2(RQ-12)上。(3)聚合物纳米颗粒特异性吸附能力研究:比较了 NP12对Cry1Ab,Cry1Ac、Cry2A、Cry1C和Cry1F的结合能力,结果发现NP12对Cry1Ab的吸附能力最强,其对Cry1Ac也具有较强的亲和力,这主要是因为Cry1Ab和Cry1Ac为同源蛋白,其氨基酸序列和等电点非常接近,其抗原表位均为domain Ⅱ loop 2368RRPFNIGINNQQ379(RQ-12)。而 Cry2A,Cry1C 和 Cry1F 与 Cry1Ab 的等电点、抗原表位均不同,因此NP12对这些非同源蛋白几乎没有亲和力。这个结果表明,依据BtCry1Ab蛋白抗原表位特点来设计合成聚合物纳米颗粒,以使其对整个Bt Cry1Ac蛋白具有特异性识别能力在理论上和实际应用上都是合理的。同样地,采用该方法还可以筛选出针对其它Bt蛋白的聚合物纳米颗粒。