【摘 要】
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目的 探讨Th17细胞ATF7ip表达水平对破骨细胞分化的作用,以及强骨饮对ATF7ip表达的调控作用方法 1.Th17细胞提取和荧光鉴定 入组人群分为三组,正常组（不用药）、骨质疏松组（口服碳酸钙D3片和骨化三醇胶囊）和治疗组（口服碳酸钙D3片、骨化三醇胶囊和强骨饮）,6个月后取其清晨空腹静脉血5mL,进行离心和培养,获得三组人群的Th17细胞,并进行CD3和CD8免疫荧光鉴定;2.ATF7ip
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目的 探讨Th17细胞ATF7ip表达水平对破骨细胞分化的作用,以及强骨饮对ATF7ip表达的调控作用方法 1.Th17细胞提取和荧光鉴定 入组人群分为三组,正常组（不用药）、骨质疏松组（口服碳酸钙D3片和骨化三醇胶囊）和治疗组（口服碳酸钙D3片、骨化三醇胶囊和强骨饮）,6个月后取其清晨空腹静脉血5mL,进行离心和培养,获得三组人群的Th17细胞,并进行CD3和CD8免疫荧光鉴定;2.ATF7ip过表达质粒载体转染与PCR检测 将三组Th17细胞进行ATF7ip过表达转染,每组分为control、NC和ATF7ip三组,提取总RNA（YEASEA,19201ES60）,进行 PCR 检测,反应程序:94℃ 5min---94℃ 30s---60℃40s---72℃ 50s---退火4℃。共30个循环,计一个半小时（PCR扩增仪,Bio-Rad）;3.原代破骨细胞提取和共培养 酒精消毒5-8周龄SD大鼠,无菌分离四肢长骨,剔除表面的软组织,用5mL注射器吸取无菌PBS冲洗骨髓腔至颜色发白,收集冲洗液至离心管内,进行破骨细胞的培养,然后选用3μm的Transwell板,下室种8*10^4个破骨前体细胞,上室接种六组细胞,分别为正常组Th17细胞、正常组Th17细胞过表达ATF7ip、骨质疏松组Th17细胞、骨质疏松组Th17细胞过表达ATF7ip、治疗组Th17细胞、治疗组Th17细胞过表达ATF7ip;4.细胞TRAP染色与WB检测 将培养的六组破骨细胞分别进行细胞TRAP染色与计数。提取六组下室破骨前体细胞,进行WB检测下室的破骨前体细胞的CSK、RANK 和 MMP9 表达。结果 治疗结束后,正常组脱落3例,骨质疏松组脱落4例,治疗组脱落6例,共采集到77例标本。1.Th17细胞做CD3和CD8鉴定,在荧光显微镜拍摄,治疗组、骨质疏松组和正常组都有较强的CD3和CD8荧光;Th17细胞进行转染时,NC使用的是pEX-1带有荧光蛋白标记,转染24h后有荧光出现,说明同样的操作情况下,基因可以转入细胞内,且三组Th1 7细胞经过ATF7ip过表达质粒载体转染后,细胞数量比Control组多,状态良好,说明Th17细胞提取和ATF7ip过表达转染效果较好。2.PCR检测结果表明经ATF7ip转染后的三组ATF7ip表达较Control组更高,且差异具有统计学意义（P＜0.05）,说明质粒载体在三组细胞中能够正常转染和表达;三组ATF7ip转染细胞中,骨质疏松组的ATF7ip的表达最高,治疗组较骨质疏松组表达减低,正常组表达最低,组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。3.TRAP染色检测下室的破骨前体细胞时,发现3组Th17细胞+ATF7ip的酒红色阳性数量均比Control组更多。对于Control组,骨质疏松组酒红色阳性数量较治疗和正常组都更多。4.3组Th17细胞+ATF7ip的CSK表达均高于对应Control组,差异有统计学意义（P＜0.05）,对于Control组,骨质疏松组CSK表达高于治疗组,差异有统计学意义（P＜0.05）;正常组+ATF7ip的RANK的表达高于正常组+Control,差异有统计学意义（P＜0.05）,骨质疏松组和治疗组+ATF7ip的RANK的表达略高于骨质疏松组+Control,差异无统计学意义（P＞0.05）,对于Control组,骨质疏松组RANK表达高于治疗组,差异有统计学意义（P＜0.05）;正常组和治疗组+ATF7ip的MMP9的表达高于对应Control组,差异有统计学意义（P＜0.05）,骨质疏松组+ATF7ip略高于骨质疏松组+Control,差异无统计学意义（P＞0.05）,对于Control组,骨质疏松组MMP9表达高于治疗组,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 PCR检测结果说明骨质疏松与ATF7ip存在一定的关联性,且强骨饮对其表达具有一定的抑制作用。TRAP染色结果说明ATF7ip可以促进破骨细胞形成,且强骨饮可以干预ATF7ip表达活性,抑制破骨细胞的形成。经WB检测,ATF7ip可以促进CSK和MMP9表达,与RANK表达无明显关联性;与骨质疏松组相比,强骨饮可能存在抑制CSK、RANK和MMP9表达的作用,达到治疗骨质疏松的目的。
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