高尿酸血症及痛风的发病率在逐年攀升,而临床上主要用作治疗高尿酸血症及痛风的药物,如别嘌呤醇、非布索坦等,存在一系列的副作用。防病胜于治病,开发出天然无毒副作用的保健食品,用以预防或改善高尿酸或痛风症状,具有非常重要的现实意义。黄嘌呤氧化酶作为尿酸代谢过程中的重要酶,直接调控尿酸的生成;肾脏尿酸转运体,如URAT1、OAT1、ABCG2、UAT和GLUT9等均可调节尿酸的分泌与重吸收,选择黄嘌呤氧化酶和肾脏尿酸转运体作为尿酸代谢过程中的作用靶点可达到明确的效果。多酚类化合物具有广泛的生物活性,逐渐受到人们的青睐。从多酚类化合物中寻找和筛选有效的黄嘌呤氧化酶抑制剂,为高尿酸血症的防治提供新的选择已受到学者的普遍关注。毛蕊花苷、咖啡酸以及羟基酪醇均为多酚类物质,具有多种生理活性。本文采用多种方法研究毛蕊花苷、咖啡酸以及羟基酪醇降尿酸水平的分子机制,以期为毛蕊花苷及其苷元相关保健品的开发中提供理论依据,也为其他天然活性物质降低尿酸水平的研究提供方法借鉴。本文的主要研究内容与结果如下:(1)建立大鼠高尿酸血症模型,用试剂盒法分析灌胃不同剂量毛蕊花苷及其苷元对大鼠相关生理指标的影响。结果表明,与正常对照组相比,模型对照组大鼠的血清尿酸、血清肌酐、血清尿素氮的浓度以及肝脏黄嘌呤氧化酶和腺苷脱氨酶的活性均具有显著性差异;与模型对照组相比,毛蕊花苷及其苷元组大鼠的血清尿酸、血清肌酐、血清尿素氮的浓度以及肝脏黄嘌呤氧化酶和腺苷脱氨酶的活性等指标水平均有不同程度下降。因此,各物质可以调节血清尿酸、肌酐和尿素氮的含量,并抑制体内黄嘌呤氧化酶和腺苷脱氨酶的活性而降低体内尿酸的生成量。对同种物质而言,高浓度下对各生理指标的影响更显著,而不同物质对大鼠生理指标的影响则不同。(2)建立大鼠高尿酸血症模型,用荧光定量PCR法分析灌胃不同剂量毛蕊花苷及其苷元对大鼠肾脏尿酸转运体基因表达的影响。结果显示,高尿酸血症大鼠肾脏中与尿酸重吸收相关的URAT1 m RNA和GLUT9 m RNA的相对表达量维持在较高水平,而与尿酸分泌相关的OAT1 m RNA、UAT m RNA和ABCG2 m RNA的相对表达量维持在较低水平。毛蕊花苷及其苷元组大鼠肾脏中的URAT1 m RNA和GLUT9 m RNA的相对表达量降低,OAT1 m RNA、UAT m RNA和ABCG2 m RNA的相对表达量升高。因此,给药各物质后,肾脏尿酸转运体URAT1、GLUT9、OAT1、UAT和ABCG2的表达量发生改变,肾脏对尿酸的重吸收能力降低、分泌能力增加,促进了体内尿酸的排出,从而降低血尿酸水平。(3)分别采用高效液相色谱法、分光光度法以及圆二光谱法,研究毛蕊花苷及其苷元对黄嘌呤氧化酶的体外抑制机制。将各物质与黄嘌呤氧化酶混合孵育不同时间,高效液相色谱法检测孵育后的各物质游离型含量,计算得出毛蕊花苷、咖啡酸和羟基酪醇在15 min内与黄嘌呤氧化酶的结合率分别为5.87%、2.05%和4.72%。将不同浓度的各物质与黄嘌呤氧化酶混合孵育,氯化硝基四氮唑蓝(NBT)显色法检测孵育后黄嘌呤氧化酶活性,测得毛蕊花苷、咖啡酸和羟基酪醇对黄嘌呤氧化酶的半数抑制浓度分别为13.05μM、72.10μM和33.95μM;双倒数作图结果表明毛蕊花苷和羟基酪醇对黄嘌呤氧化酶的抑制类型为混合型抑制,而咖啡酸则为竞争型抑制。圆二光谱法结果表明黄嘌呤氧化酶的主要二级结构为α-螺旋,达59.3%,β-折叠和β-转角含量较低;毛蕊花苷及其苷元与黄嘌呤氧化酶的结合,可以改变黄嘌呤氧化酶的二级结构,随着各物质添加量的增加,黄嘌呤氧化酶α-螺旋结构逐渐降低,而β-折叠、β-转角和无规卷曲的含量均有所升高。从体外抑酶结果可知,毛蕊花苷及其苷元会与黄嘌呤氧化酶发生分子间结合,并改变酶的二级结构,使得黄嘌呤氧化酶分子结构的有序性下降,阻断其与底物黄嘌呤结合,从而抑制酶的活性。(4)采用分子对接技术,分别将毛蕊花苷及其苷元与黄嘌呤氧化酶的钼喋呤活性中心以及黄素腺嘌呤二核苷酸辅因子活性区域进行对接。对接结果显示毛蕊花苷和羟基酪醇在两个活性区域均有结合,其中毛蕊花苷与黄素腺嘌呤二核苷酸辅因子活性区域的结合能(-6.95 kcal/mol)小于与钼喋呤活性中心结合能(-6.82 kcal/mol),与之相反,羟基酪醇与钼喋呤活性中心结合能(-6.14kcal/mol)小于与黄素腺嘌呤二核苷酸辅因子活性区域的结合能(-5.07 kcal/mol);咖啡酸仅能结合黄嘌呤氧化酶的钼喋呤活性中心,结合能为-5.72 kcal/mol。根据对接结果,可以推断毛蕊花苷及其苷元可以作为黄嘌呤氧化酶的抑制剂,但其抑制机理不同。毛蕊花苷和羟基酪醇既能占据底物进入活性中心的通道,还能阻隔电子的传递;而咖啡酸与底物黄嘌呤竞争型结合黄嘌呤氧化酶的活性区域。