纳豆激酶发酵工艺条件优化及其在消化液中的活性研究

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心血管疾病(CVDs)是目前全球死亡率很高的疾病,每年死于该病的人数高达1500万人,居各种疾病死因首位。同传统溶栓药物相比,纳豆激酶因其较好的纤溶酶活,且半衰期长、可口服、副作用小等优点,被视为血栓治疗的良药。目前纳豆激酶生产主要是用大豆发酵而成,而豆粕为主要原料生产纳豆激酶的研究未见报道。现有的纳豆激酶活性测定方法费用昂贵或耗时,不适合纳豆激酶生产在线检测。本实验以降低发酵成本并同时提高酶活为研究切入点,对纳豆激酶经济快速检测方法、最适发酵工艺及其在消化液中活性进行研究,主要结果如下:对测定纳豆激酶酶活的琼脂糖-纤维蛋白平板法、Folin-酚法、四肽底物法等方法进行了比较研究,并发现了一种测定纳豆激酶活性的经济、快速的新方法:建立了酶活和A680nm之间的关系,既缩短了酶活测定时间,还降低了测定成本。从碳源的选择、碳氮比例、培养基含水量、发酵时间、接种量、发酵温度和添加金属离子7个方面对纳豆激酶固体发酵条件进行单因素分析,并通过四因素三水平的正交试验得出最适发酵工艺:发酵温度40℃,豆粕140%含水量、10%接种量、发酵时间36h,产物酶活为3203.260IU/g,较优化前提高了12.5%;通过干燥温度和时间的单因素实验,得出了固体发酵物的最适干燥条件是70℃,8h,干燥后纳豆激酶的酶回收率是61.4%。对液体发酵条件的氮源、碳源等条件进行基础优化,酶活一直在200IU/mL左右,较优化之前提高了19.5IU/mL。此外,60Coγ射线诱变育种筛选出了一株酶活提高4.5%的纳豆菌株。纳豆激酶三种不同形式的固体样品(不粉碎样、机械粉碎样和超微粉碎样)经人工胃液处理4h后,仍能保持80%左右的酶活,而粗酶溶液经处理0.5h后,活性迅速下降45%,以后的处理酶活下降速度有所减缓,至4h时,酶活是初始酶活的48.6%。经过人工胃液和人工肠液依次处理4h后,机械粉碎样和超微粉碎样仍有47.0%和51.0%的活性。经过人体消化液的处理,机械粉碎和超微粉碎样品的酶活逐渐增大至初始酶活,而粗酶液则在处理0.5h后即开始下降,处理4h后,酶活减小至初始酶活的79.8%。
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