【摘 要】
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黄曲霉毒素M1（Aflatoxin M1,AFM1）是黄曲霉毒素B1在体内经羟基化形成的代谢产物,WHO国际癌症研究机构已将其列为ⅡB类致癌物,由AFM1引起的食品安全问题已经成为世界各国关注的焦点。酶联免疫吸附方法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）由于具有操作简单、特异性强,高通量等优点,广泛应用在食品污染物的快速检测。然而该技术也存在检测灵敏度低
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黄曲霉毒素M1（Aflatoxin M1,AFM1）是黄曲霉毒素B1在体内经羟基化形成的代谢产物,WHO国际癌症研究机构已将其列为ⅡB类致癌物,由AFM1引起的食品安全问题已经成为世界各国关注的焦点。酶联免疫吸附方法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）由于具有操作简单、特异性强,高通量等优点,广泛应用在食品污染物的快速检测。然而该技术也存在检测灵敏度低、酶活性易受外界影响等不足。近年来新型功能化材料结合多种核酸信号放大技术,在提升检测方法灵敏度方面展现了良好的应用前景。本研究以AFM1为代表,结合间接竞争酶联免疫吸附法和生物条形码（Bio-barcode assay,BCA）实现核酸信号放大,构建了食品中AFM1的高灵敏多重信号扩增-荧光免疫传感检测新技术,研究成果如下:（1）间接竞争ELISA检测AFM1的技术研究。采用琥珀酸酐法合成AFM1-BSA免疫全抗原,通过优化全抗原和抗体浓度、包被条件、封闭液、酶标二抗浓度、TMB显色时间等条件,建立了AFM1的间接竞争ELISA检测方法。检出限IC10为3.84 pg/mL,线性范围9.743 pg/mL～2.605 ng/mL,标准曲线方程y=0.2472lgx-0.0444（R~2=0.9927）。将该方法用于奶粉、玉米面等实际样品中AFM1的测定,回收率在88.43%～105.75%之间。本研究为下一步高灵敏免疫检测体系构建奠定了基础。（2）AFM1检测的双重信号扩增-生物条形码荧光传感技术研究。以AFM1单克隆抗体和生物条形码修饰二氧化硅微球作为识别载体和信号放大探针,AFM1全抗原包被酶标板,利用AFM1与全抗原的竞争结合反应,结合树突状杂交链式反应双重放大实现高灵敏检测。方法线性范围10 pg/mL～10μg/mL,线性方程y=352.11lgx+1990.18（R~2=0.9947）,检出限5.41 fg/mL。与间接竞争ELISA检测技术相比,检测灵敏度提升3个数量级。考察了对结构类似物黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的抗干扰性能,结果表明该方法具有良好的特异性。以奶粉和咖啡等样品为代表验证了方法的适用性,回收率在84.77%～115.70%之间,可满足食品中AFM1高灵敏度检测需求。（3）AFM1检测的isHCR信号放大快速荧光传感技术研究。在间接竞争ELISA检测方法的基础上,引入生物素亲和素放大体系和免疫信号杂交链式反应（isHCR）,对链霉亲和素浓度、树突链S添加量等条件进行了优化,初步构建了AFM1的isHCR荧光传感检测技术。但现有体系尚存在生物素和荧光基团双功能修饰的单链DNA与链霉亲和素分子结合效率较低的不足,相关实验还需进一步优化。本论文在间接竞争ELISA的基础上,构建了基于树突状HCR双重扩增的AFM1免疫生物条形码检测技术,与传统间接竞争ELISA相比,双重信号扩增-生物条形码荧光传感技术具有检测范围宽,灵敏度高等技术优势。初步探索了基于isHCR的AFM1快速荧光传感检测技术,为进一步发展快速高灵敏技术奠定了一定的基础,但相关研究需要进一步深入。本研究建立的方法具有通用性,可为其他污染物的检测提供思路,具有良好的实际应用前景。
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