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背景与目的前期已经通过实验得出结论,即Smad3基因C端磷酸化位点突变促进的Smad3C-末端磷酸化/Smad3连接区磷酸化（p Smad3C/p Smad3L）之间信号转化从而促进肝纤维化-肝癌的发生。另外丹酚酸B（Sal B）也被验证可以延缓肝纤维化-肝癌进程。本课题主要研究当小鼠体内Smad3 C磷酸化位点被突变时,对Sal B抗二乙基亚硝胺（DEN）诱导小鼠肝纤维化-肝癌作用的影响,从而进一步明确Sal B抗肝纤维化-肝癌作用与p Smad3C/p Smad3L之间相互转化的联系。方法将成功构建的C57BL/6J小鼠Smad3 C末端磷酸化位点突变杂合子小鼠进行扩繁、鉴定,筛选出雄性6周龄杂合子小鼠(基因型:p Smad3C+/-)及其同源野生型小鼠(基因型:p Smad3C+/+)各60只,实验分组:野生型小鼠正常对照组、野生型小鼠DEN组、野生型小鼠DEN+Sal B组、杂合子小鼠正常对照组、杂合子小鼠DEN组、杂合子小鼠DEN+Sal B组,20只/组。除对照组外,其余组小鼠予以建立DEN诱发性肝纤维化-肝癌模型,于造模之日起,含Sal B干预组小鼠同步予以灌胃相应剂量（15 mg/kg/d）的药物,其余组小鼠予以溶媒同步处理。分别于造模起第18周末、第23周末处死小鼠（n=8）,取肝组织,常规固定、石蜡切片、HE/VG染色,光学显微镜下观察肝脏的组织病理学特征,评估肝组织病变情况;取新鲜或冷冻肝组织,提取总蛋白,Western-blot法检测肝纤维化病变标志物α-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）、癌前标志物胎盘型谷胱甘肽S转移酶（GST-P）、p Smad3C、p21、p Smad3L、纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）、c-Myc蛋白水平,以探究Sal B抗DEN诱发的肝脏纤维化病变-癌变发生及进展作用与p Smad3C/p21与p Smad3L/PAI-1/c-Myc信号转换的关系。结果1. Smad3 C末端基因磷酸化位点突变减弱Sal B抗小鼠肝纤维化作用DEN造模18周,实验结果显示,野生型和杂合子两种基因型小鼠对照组在肝指数,血清转氨酶和病理均正常且两种基因鼠之间均无显著性差异。两种基因型小鼠DEN组与其对照组相比,体重肝重降低;血清转氨酶显著性升高;HE染色和VG染色结果显示,有炎细胞聚集和胶原纤维增多;Western-blot结果显示a-SMA和GST-P表达显著性升高;并且以上指标均显示杂合子病变程度高于野生型。Sal B组两种基因型小鼠病变相较于其DEN组均有改善,并且野生型与杂合子相比病变改善更为显著。2. Smad3 C末端基因磷酸化位点突变抑制Sal B抗肝纤维化过程中p Smad3C、p21蛋白的上调18周末DEN造模组小鼠肝组织中p Smad3C和p21显著降低,并且杂合子比野生型降低更为显著;Sal B治疗组p Smad3C和p21蛋白水平与其DEN组相比均升高,野生型升高更为显著。3. Smad3 C末端基因磷酸化位点突变抑制Sal B抗肝纤维化过程中p Smad3L、PAI-1、c-Myc蛋白的下调18周末DEN造模组小鼠肝组织中p Smad3L、PAI-1和c-Myc升高,并且杂合子比野生型升高更为显著;Sal B治疗组p Smad3L、PAI-1和c-Myc蛋白水平与其DEN组相比均降低,野生型降低更为显著。4. Smad3 C末端基因磷酸化位点突变减弱Sal B抗小鼠肝癌作用DEN造模23周,实验结果显示,野生型和杂合子两种基因型小鼠对照组在肝指数,血清转氨酶和病理均正常且两种基因鼠之间均无显著性差异。两种基因型小鼠DEN组与其对照组相比,体重和肝重降低,肝指数升高;血清转氨酶显著性升高;HE染色结果显示,肝组织显示有局部细胞坏死,核异型明显;Western-blot结果显示GST-P表达显著性升高;并且以上指标结果杂合子改变程度均高于野生型。Sal B组两种基因型小鼠病变相较于其DEN组均有改善,并且野生型比杂合子病变改善更为显著。5. Smad3 C末端基因磷酸化位点突变抑制Sal B抗肝癌过程中p Smad3C、p21蛋白的上调23周末DEN造模组小鼠肝组织中p Smad3C和p21显著降低,并且杂合子比野生型降低更为显著;Sal B治疗组p Smad3C和p21蛋白水平与其DEN组相比均升高,野生型升高更为显著6. Smad3 C末端基因磷酸化位点突变抑制Sal B抗肝癌过程中p Smad3L、PAI-1、c-Myc蛋白的下调23周末DEN造模组小鼠肝组织中p Smad3L、c-Myc升高,并且杂合子比野生型升高更为显著;而PAI-1表达较少,这可能与小鼠肝癌细胞坏死发生液化有关。Sal B治疗组p Smad3L和c-Myc蛋白水平与其DEN组相比均降低,野生型降低更为显著;PAI-1表达上升,这可能是Sal B治疗使得肝细胞坏死减少所致。结论1.Smad3 C末端基因磷酸化位点突变减弱Sal B抗小鼠肝纤维化-肝癌作用病理进程。2.Smad3 C末端基因磷酸化位点突变抑制Sal B抗肝纤维化-肝癌过程中p Smad3C/p21信号通路的上调。3.Smad3 C末端基因磷酸化位点突变抑制Sal B抗肝纤维化-肝癌过程中p Smad3L/PAI-1//c-Myc信号通路的下调。