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叶霉病是番茄生产上的重要病害。本文从形态学和分子生物学两方面对番茄叶霉病菌及其相似种进行了种类鉴定,建立了番茄叶霉病菌的ISSP-PCR优化体系,并进行了引物筛选和菌株的遗传多样性分析。研究结果如下:
(1)在2008-2009年间,在山东省的14个市、县、镇的主要番茄产区,采集不同番茄品种的叶霉病病叶标样,采用改进的单孢分离的方法对各个样品进行分离纯化,共得到21个菌株,根据培养性状和形态学特征并结合rDNA-ITS序列分析对其进行鉴定,其中19个菌株为同一个种,即黄钉孢Passalorafulva(Cooke)U.Braun&Crous,其余2个菌株分别为枝状枝孢Cladosporiumcladosporioides(Fresen.)G.A.deVries和球孢枝孢CladosporiumsphaerospermumPenz。
(2)番茄叶霉病菌培养基筛选结果表明,在PDA、OA、MEA和V8汁4种固体培养基以及PD、PS、V8汁3种液体培养基中,MEA为最适宜的固体培养基,V8汁液体培养基为最适宜的液体培养基。
(3)番茄叶霉病菌基因组DNA提取方法比较试验表明:CTAB法效果最佳,SDS-CTAB法次之,尿素法效果最差。
(4)本文首次建立了番茄叶霉病菌的ISSP-PCR优化体系。以番茄叶霉病菌Passalorafulva基因组DNA为模板,采用单因素试验和正交设计试验对该菌ISSR-PCR体系中的一些重要参数(Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA、TaqDNA聚合酶、缓冲液、循环次数)进行优化,并对退火温度进行了梯度优化,建立了番茄叶霉病菌ISSR-PCR的最佳反应体系,20μL反应体系中,Mg2+浓度1.5mM,dNTPs浓度0.4mM,引物1.5μM,模板DNA45ng,TaqDNA聚合酶1.5U,1倍的PCR缓冲液,循环次数为40次,退火温度为50℃。
(5)从100条ISSR通用引物中筛选出10个扩增条带清晰、重复性好及多态性高的引物,并进行扩增和分析。采用NTSYS2.1软件对矩阵进行遗传分析,形成聚类图。在相似系数为0.700时,可将试验菌株分为3个类群。图谱分析结果表明,ISSR图谱多样性与菌株的培养性状之间存在一定的相关性,表明这些菌株存在生理分化。