商业化牛奶的抗氧化活性及其外泌体抑制LPS诱导的炎症反应

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随着《国民营养计划(2017-2030)》及健康中国行动(2019-2030年)的发布,人们对食品的营养和功能性日益关注。乳制品是消费者重要营养来源之一,目前,我国牛乳采用的大多为巴氏灭菌及高温灭菌两种方式,灭菌温度的不同可能会导致其蛋白质、酶等热不稳定性的抗氧化物质降解,也可能导致牛乳发生美拉德反应,从而使牛乳的营养价值发生变化。本文选用18款市售牛乳制品,通过对其进行抗氧化和抗炎活性研究,探讨不同乳源及加工方式对商品化牛乳潜在活性的影响;从抗氧化活性较好的牛乳中提取外泌体,并探究不同牛乳的外泌体对调节LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞释放炎症因子的含量变化,为商品化牛乳中外泌体的免疫调节功能提供理论参考。主要研究结果如下:1.不同牛乳脂肪、蛋白质含量以及抗氧化活性差异目前,商品化牛乳主要分为两类,分别为巴氏灭菌乳和高温灭菌乳,两者的主要区别在于杀菌时温度的控制,温度的不同导致牛乳的抗氧化活性存在差异。首先分析18种不同牛乳的脂肪以及蛋白质含量,18款牛乳中9号及12号为脱脂纯牛奶,其余为全脂纯牛奶,发现在牛乳中添加酪蛋白可能增加牛乳蛋白质含量。随后,通过测定ABTS自由基、DPPH自由基和羟自由基清除率以及ORAC,评价牛乳的抗氧化活性。结果发现,高温灭菌乳的抗氧化活性高于巴氏灭菌乳,全脂牛乳高于脱脂牛乳,有机纯牛奶高于普通纯牛奶。并将4个指标进行交叉分析,按照3个品牌以及两种灭菌方式进行筛选,最终选择11款牛乳(2、3、4、6、7、8、9、10、14、17号和18号)进行后续研究。2.牛乳中micro RNA-718表达量及外泌体的提取、鉴定通过RNA提取试剂盒提取牛乳中的RNA,选择U6作为内参基因,应用RT-PCR技术对筛选的11款牛乳中micro RNA-718进行相对表达量分析,其中,9号脱脂乳制品micro RNA-718的基因表达水平最高,为801.06±34.11,显著高于其他乳制品(p<0.05),6号、10号和4号次之,分别为27.35±5.14、23.84±3.64和14.03±4.52。随后,提取4号、6号、9号和10号牛乳外泌体,采用马尔文粒径分析、透射电子显微镜以及蛋白免疫印迹对外泌体的结构及表面标志蛋白进行鉴定。结果表明,4个样品中提取的外泌体的峰值均只有一个,范围在50-200 nm之间;各样品中的外泌体结构为圆形或椭圆形,并呈磷脂双层结构。其中,4号外泌体背景清晰,6号、9号和10号背景模糊,含有较多的杂质蛋白。4个样品的外泌体均出现聚集现象,没有分散均匀。此外,在蛋白免疫印迹中,4个样品外泌体表面均有TSG101标志性蛋白。综上所述,通过试剂盒提取的4个样品的外泌体均符合标准,可用于进一步研究。3.牛乳中外泌体抑制LPS介导的炎症反应作用研究在RAW264.7巨噬细胞中建立了LPS诱导的炎症模型,通过ELISA检测炎症因子的含量并通过Western blot测量i NOS和COX-2蛋白的表达水平。探讨4号、6号、9号和10号牛乳中外泌体对LPS介导炎症反应的抑制作用。结果表明,LPS介导RAW274.7巨噬细胞提高细胞NO释放量,并上调巨噬细胞的炎症反应,表明模型建立成功。与模型组相比,4种样品的外泌体均能显著降低炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量(P<0.05),并下调i NOS和COX-2的蛋白表达水平。综上所述,不同乳制品中外泌体均可以提高巨噬细胞的免疫调节功能。
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