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目的:1.研究Klotho与早期DN患者足细胞损伤的相关性;2.探讨Klotho在DN足细胞损伤中的保护作用及机制;3.阐明AS-Ⅳ通过Klotho改善DN足细胞损伤的作用机制。方法:1.Klotho与早期DN患者足细胞损伤相关性的临床研究依据尿白蛋白肌酐比值（UACR）把研究对象分组,采用qRT-PCR技术检测健康体检者、单纯糖尿病和早期DN患者的Klotho、Nephrin和Podocin的表达。2.Klotho在DN足细胞损伤中的保护作用及机制研究通过PAS染色、电镜、免疫荧光和Western blot检测16周龄db/db小鼠肾脏病理变化、足细胞损伤以及Klotho和瞬时受体势C6（Transient Receptor Potential Channel 6,TRPC6）在DN足细胞损伤中的表达变化。通过尾静脉注射Klotho过表达腺病毒,观察Klotho对DN足细胞的保护作用。采用qRT-PCR和Western blot检测高糖诱导人足细胞损伤模型中Klotho基因表达;分别通过腺病毒过表达或si RNA基因沉默技术,结合TRPC6激动剂干预,观察Klotho对足细胞细胞骨架、Synaptopodin以及TRPC6表达的影响。3.AS-Ⅳ通过Klotho/TRPC6途径改善DN足细胞损伤的作用及机制研究给予db/db及db/m小鼠不同剂量AS-Ⅳ灌胃,随后监测体重及机体理化指标。采用PAS染色、电镜、TUNEL染色法观察肾脏病理变化和肾小球细胞凋亡,q RT-PCR、Western blot、免疫荧光检测Klotho、Synaptopodin、Nephrin、Podocin、Bcl-2、Bax、Caspase3和TRPC6的表达。培养足细胞,采用免疫荧光、Western blot和流式细胞术检测不同浓度AS-Ⅳ对足细胞Klotho和TRPC6的调控作用,以及对高糖诱导的足细胞损伤的改善作用。进而,si RNA沉默Klotho表达,Western blot和流式细胞术检测Nephrin、Podocin和Bcl-2、Bax、Caspase3的表达和细胞凋亡。结果:1.早期DN患者血清Klotho水平降低并与足细胞损伤密切相关:单纯糖尿病组和早期DN组患者血清Klotho、Nephrin及Podocin mRNA水平均低于健康对照组,差异均有统计学意义（均P＜0.01）;与单纯糖尿病组比较,早期DN组患者血清Klotho、Nephrin、Podocin m RNA水平明显降低,差异均有统计学意义（分别为P＜0.05、P＜0.05和P＜0.01）;Pearson相关分析显示,血清Klotho水平与Nephrin、Podocin均呈正相关,多元回归分析提示血清Klotho水平与Nephrin关系密切。2.Klotho可通过抑制下游信号分子TRPC6的表达保护DN足细胞损伤:（1）与LG组比较,HG刺激足细胞48 h时,足细胞骨架破坏明显加重,Synaptopodin和Klotho表达均显著下调,TRPC6表达明显增加（均P＜0.01）。（2）与HG组比较,Klotho过表达组显著抑制足细胞骨架破坏,Synaptopodin和Klotho表达均显著上调,同时TRPC6表达显著下降（均P＜0.01）;敲低Klotho则可以显著加重足细胞骨架破坏,Synaptopodin和Klotho表达均明显下降,伴随TRPC6表达显著增加（均P＜0.01）。Klotho过表达联合TRPC6激动剂组与单纯过表达Klotho组比较显示,足细胞损伤加重,明显抵消了Klotho过表达对足细胞的保护作用（P＜0.01）。（3）与db/m小鼠比较,db/db小鼠足细胞病理损伤明显加重,Klotho和Synaptopodin表达显著降低,TRPC6表达上调（均P＜0.01）;过表达Klotho的db/db小鼠组蛋白尿明显减少,足细胞病理损伤减轻,同时TRPC6表达明显下降（均P＜0.01）。3.AS-Ⅳ可上调Klotho、下调TRPC6表达,保护DN足细胞损伤:（1）与HG组比较,40μM AS-Ⅳ组可显著改善足细胞凋亡,增加Klotho、Nephrin、Podocin、Bcl-2表达,降低Bax、TRPC6表达和Caspase3的活性（均P＜0.01）;沉默Klotho后,AS-Ⅳ改善HG刺激足细胞凋亡作用下降（P＜0.05）,且对以上蛋白的调节作用均显著逆转（均P＜0.01）。（2）与db/db小鼠相比,18 mg/kg AS-Ⅳ干预组小鼠体重和血糖均显著下降,肾功能指标BUN和UACR明显降低,足细胞损伤的病理变化显著改善（P＜0.01）。此外,AS-Ⅳ能够显著上调Klotho、Nephrin、Podocin和Bcl-2的表达,抑制TRPC6、Bax表达和Caspase 3活性,且呈剂量依赖性（均P＜0.01）。结论:1.早期DN患者血清Klotho水平降低可能参与了足细胞损伤;2.TRPC6是Klotho的下游信号分子,Klotho可通过抑制TRPC6的表达改善DN足细胞损伤;3.AS-Ⅳ可改善db/db小鼠足细胞损伤,具有肾脏保护作用,其作用机制可能与调节Klotho/TRPC6信号通路有关,为AS-Ⅳ防治DN提供新的药物作用靶点和依据。