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目的:心血管疾病由于其发病率和病死率很高,已成为危害人类健康的头号杀手,而细胞能量代谢障碍又是引发心血管疾病的重要原因,寻求有效治疗细胞能量代谢障碍的药物,是当前研究的热点。寡霉素敏感相关蛋白（oligomycinsensitivity-conferring protein,OSCP）作为ATP合酶的一个重要亚基,在细胞能量代谢中发挥着重要作用。缺血预适应（ischemic preconditioning,IPC）对缺血心肌的保护作用与ATP合酶活性的升高有密切关系。本实验采用基因工程的方法克隆ATP合酶中的OSCP基因,并构建其真核表达载体,这为以后对该基因在真核细胞中过表达、蛋白活性的检测以及研究OSCP在细胞能量代谢、IPC中的作用奠定了基础。方法:1.扩增大鼠OSCP基因:首先取SD大鼠脑组织50 mg左右,依照Trizol试剂说明书中步骤提取总RNA。根据OSCP基因的开放阅读框设计合成一对引物。用RT-PCR方法扩增出编码OSCP基因的全长序列,分离纯化PCR产物。2.构建重组克隆载体pTA2-OSCP:将PCR产物与pTA2克隆载体连接,连接产物转化入E.coli JM109感受态细菌,摇菌扩增,提取质粒DNA,用EcoR I进行酶切鉴定,筛选出阳性重组质粒进行DNA序列测定,测序结果用GeneRunner软件分析。3.构建重组表达载体pEGFP-N1-OSCP:重组质粒pTA2-OSCP和真核表达载体pEGFP-N1分别经BglⅡ/EcoR I酶切,然后通过T4连接酶连接,转化入E.coliDH5α感受态细菌,摇菌扩增,提取质粒DNA。经BglⅡ/EcoR I酶切鉴定,筛选出阳性重组质粒进行DNA序列测定,测序结果用Gene Runner软件分析。结果:1.OSCP基因的的RT-PCR扩增:总RNA的OD260nm/OD280nm为1.87,纯度符合实验要求;甲醛变性琼脂糖凝胶电泳结果表明所提总RNA的完整性好;琼脂糖凝胶电泳结果显示RT-PCR产物的长度约为700 bp,与预期结果相符。2.重组克隆载体pTA2-OSCP的鉴定:重组克隆载体pTA2-OSCP经EcoR I限制性内切酶鉴定,得到约3000 bp的线性片段和约700 bp的插入片段,与预期结果相符;选取阳性克隆载体进行测序,与已公布的大鼠OSCP基因序列比较分析,同源性为100%。证明pTA2-OSCP重组克隆载体构建成功。3.重组表达载体pEGFP-N1-OSCP的鉴定:重组表达载体pEGFP-N1-OSCP经BglⅡ/EcoR I双酶切得到约为4700 bp的线性片段和约700 bp的插入片段,与预期结果相符;选取阳性重组表达载体进行测序分析,与已公布的大鼠OSCP基因序列比较,同源性为100%。证明重组表达载体pEGFP-N1-OSCP构建成功。结论:1.通过RT-PCR扩增出了大鼠OSCP基因。2.重组克隆载体pTA2-OSCP构建成功。3.重组真核表达载体pEGFP-N1-OSCP构建成功。