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旋毛虫是一种人畜共患寄生虫,感染旋毛虫可以引起水肿等症状,轻者发生在眼睑面颊,严重病例可产生胸腹水。旋毛虫感染所引起的水肿原因之一是血管内皮细胞通透性的增加。细胞凋亡和细胞间连接蛋白的表达量减少均可引起血管内皮细胞通透性增加。本实验为了验证旋毛虫感染对血管内皮细胞通透性的影响,使用旋毛虫ES抗原和旋毛虫p53糖蛋白重组蛋白（Ts-p53）进行刺激人脐静脉内皮细胞（HUVEC）,以探究旋毛虫ES抗原和Ts-p53对HUVEC通透性影响的研究。在旋毛虫ES抗原与HUVEC互相作用后,通过荧光渗漏法检测细胞通透性,结果表明随着旋毛虫ES抗原刺激浓度的增加和刺激时间的延长,HUVEC通透性的升高。用CCK-8方法检测发现,随着旋毛虫ES抗原刺激浓度的增加和刺激时间的延长,HUVEC活性降低。通过荧光定量PCR（qPCR）和Western Blot检测发现,ES抗原刺激细胞后细胞间连接蛋白VE-cadherin和ZO-1的转录和表达均减少。说明旋毛虫ES抗原可以通过降低细胞活性和破坏细胞间连接蛋白两种方式,提高HUVEC的通透性。在旋毛虫p53重组蛋白（Ts-p53）与HUVEC相互作用后,荧光渗漏法检测发现随着Tsp53刺激浓度的增加和刺激时间的延长,HUVEC通透性升高。CCK-8法检测细胞活性后发现随着Ts-p53刺激浓度的增加和刺激时间的延长,HUVEC细胞活性降低。继而收集Ts-p53刺激后细胞培养液,进行乳酸脱氢酶（LDH）检测,结果表明HUVEC受到Ts-p53刺激后,会有大量LDH被释放到细胞外,说明HUVEC细胞膜的通透性发生改变。在使用Annexin-V/PI双染色法检测发现,Ts-p53可以诱导HUVEC细胞中Annexin-V/PI阳性细胞的增加。使用荧光探针DCFH-DA标记法检测细胞中ROS的释放,结果表明Ts-p53可以诱导HUVEC产生大量ROS。这些结果说明TS-p53的刺激诱导了HUVEC氧化应激的发生。通过qPCR和Western Blot方法检测HUVEC中Bax和BCl-2的变化,结果表明,Bax的转录水平和蛋白表达水平在刺激3 h、6 h和12 h后显著升高（p＜0.01）。而Bcl-2的转录水平和蛋白表达水平在刺激3 h、6 h和12 h后显著降低（p＜0.01）,Bax/Bcl-2的值升高。有研究证实Bax与Bcl-2的平衡被破坏可能引起线粒体膜电位（MMP）的变化,使用JC-10检测MMP发现,Ts-p53刺激HUVEC后可以引起MMP的下降,说明Ts-p53可以使线粒体膜通透性增加。使用Western Blot检测发现,经Ts-p53刺激后,HUVEC中Cytochrome C蛋白表达含量增加,活化的Caspase-9和Caspase-3的蛋白表达水平增加。说明Ts-p53可以引起HUVEC发生线粒体凋亡。通过qPCR和Western Blot方法检测细胞间连接蛋白ZO-1和VE-cadherin,在Ts-p53刺激后,ZO-1和VE-cadherin的蛋白表达下降,说明Ts-p53可以破坏细胞间的连接蛋白。由此可见,Tsp53可以激活HUVEC中的线粒体凋亡通路、破坏内皮细胞间连接蛋白两种方式破坏内皮细胞屏障,增加HUVEC通透性。为了研究ROS对于诱导HUVEC凋亡的作用,本研究使用ROS抑制剂（NAC）对HUVEC进行处理。通过荧光渗漏法检测发现NAC可以显著抑制由Ts-p53导致的通透性升高。CCK-8检测HUVEC细胞活性后结果显示,NAC可以显著抑制由Ts-p53刺激引起的HUVEC细胞活性的降低。细胞培养液中LDH的含量检测表明NAC可以显著抑制由Ts-p53刺激引起的LDH的释放。通过Western Blot检测发现,与空白对照组相比,细胞中Bax、Cytochrome C、激活状态下的Caspase-3、Caspase-9的基因转录水平和蛋白表达量均显著低于Ts-p53刺激组（p＜0.01）,线粒体抗凋亡基因Bcl-2的基因转录水平和表达量与高于Ts-p53刺激组（p＜0.01）。由此可见,Ts-p53引起的HUVEC的凋亡依赖于ROS。为了研究TLR4引起氧化应激和细胞凋亡的作用,使用TLR4抑制剂（TAK242）对HUVEC进行处理。qPCR和Western Blot检测发现,Ts-p53可以促进TLR4的转录和表达增加,SOD2的转录和表达减少,且TAK242可以抑制TLR4的表达。TAK242处理的细胞经Ts-p53刺激后,细胞中SOD2的转录水平和表达水平均显著高于Ts-p53刺激组。使用荧光探针DCFHDA标记法检测细胞中ROS的释放,结果表明TAK242可以抑制Ts-p53引起的HUVEC中ROS增加,说明TAK242可以抑制ROS的累积。qPCR和Western Blot检测结果表明,TAK242可以抑制Ts-p53引起的Caspase-3活化,表明TAK242可以抑制线粒体凋亡的发生。由此可见,Ts-p53引起HUVEC发生氧化应激和细胞凋亡通过TLR4调控。综上所述,旋毛虫ES抗原刺激HUVEC后,通过降低细胞活性、破坏细胞间连接蛋白两个方面,增高HUVEC的通透性。Ts-p53从引起HUVEC发生线粒体凋亡、减少内皮细胞间连接蛋白表达两个方面破坏血管内皮屏障,降低了HUVEC通透性。对Ts-p53引起HUVEC发生线粒体凋亡的研究中发现,Ts-p53可以刺激HUVEC产生TLR4,引起细胞发生氧化应激产生大量的ROS,破坏细胞中Bax/Bcl-2的平衡,使线粒体中大量Cytochrome C释放,从而激活Caspase-9和Caspase-3,最终引发细胞凋亡。本研究证明了旋毛虫p53蛋白刺激HUVEC导致通透性的增加,并能刺激HUVEC发生细胞凋亡。