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孕激素受体与子宫内膜异位症发病机制的研究目的子宫内膜异位症（endometriosis EMS）为子宫内膜生长在子宫腔以外部位的妇科常见疾病。因有盆腔痛、复发率高和不孕的特点，成为临床棘手的病症，故其病因学研究意义重大。该病的发病机制尚不清楚。最广为接受的理论是经血逆流学说，但90％的妇女有经血逆流，仅10-15％发病，目前认为后者的易感性在于遗传素质的差别，可能与经血碎片暴露时间的增加，在位子宫内膜的异常，腹腔内环境的改变，免疫监视的削弱和血管生成能力的增强有关。家系和流行病学研究认为该病是一种多因素、多基因疾病，是多个基因位点与环境因素间相互作用的结果。根据子宫内膜异位症在分子生物学和临床上具有激素依赖性和遗传学家族聚集性的特点，以及“孕酮抵抗”与子宫内膜异位症发病关系的理论，本研究重点着眼于孕激素受体（PR）开展研究。分别研究孕激素受体基因表达、孕激素受体基因多态性、以及孕激素受体启动子甲基化模式，目的是探讨孕激素受体与子宫内膜异位症发病的关系；此外，因为17β羟类固醇脱氢酶2（17βHSD 2）在雌激素代谢中参与雌激素灭活，孕激素通过PR调节17βHSD 2的产生，为探讨子宫内膜异位症雌激素依赖性的机制，故同时研究17βHSD 2在子宫内膜异位症的表达。材料与方法一、材料1、标本：（1）外周血（2）子宫内膜，分三部分处理：a．立即-70℃冻存。b．10％福尔马林固定。c．建立裸鼠内异症模型：将子宫内膜尽快接种到裸鼠腹腔。7天后从裸鼠体内取出异位病灶，分别-70℃冻存和10％福尔马林固定。（3）卵巢巧克力囊肿组织2、DNA和RNA提取试剂。3、Western blot相关试剂4、RT-PCR相关试剂5、免疫组化相关试剂二、方法1、PCR方法：常规苯酚、氯仿法提取异位症和对照组患者末梢血白细胞基因组DNA。PCR法检测PR基因多态性。2、Western blot方法：提取异位症和对照组（宫颈上皮内瘤样病变）患者在位内膜、两组配对裸鼠移植后的异位内膜及卵巢巧克力囊肿组织蛋白，免疫沉淀，检测蛋白表达量。3、RT-PCR方法：Trizol提取异位症和对照组患者在位内膜和卵巢巧克力囊肿壁异位内膜组织总RNA，反转录合成第一链，PCR扩增17βHSD 2产物，检测mRNA。4、甲基化PCR（methylation-specific PCR，MSP）：苯酚／氯仿法提取DNA后，亚硫酸氢钠修饰。PCR检测异位症和对照组患者在位内膜和卵巢巧克力囊肿组织甲基化、非甲基化基因。5、免疫组化：采用SP法。两种孕激素抗体（PRA＋B和PRB抗体）分别用于鉴别异位症患者和对照组子宫内膜PRA与PRB的表达。抗PRA＋B抗体同时识别两种同源受体，抗PRB特异性识别PRB，而PRA只有用PRA＋B去除PRB作为参考。6、统计学方法：结果应用SPSS软件进行统计学处理，采用t检验和卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。结果1、Western blot检测孕激素受体蛋白结果内异症组28例，对照组15例，在位内膜PRA蛋白全部呈阳性表达，内异症组PRA相对表达量低于对照组，但无统计学意义，p＞0.05。内异症组在位内膜PRB蛋白全部呈阴性表达，对照组在位内膜PRB蛋白全部呈阳性表达，内异症组PRB蛋白相对表达量显著低于对照组（p＜0.01）；内异症组20例，对照组10例裸鼠异位灶PRA蛋白全部呈阳性表达，两组相对表达量比较差异无统计学意义，p＞0.05。内异症组实验鼠异位内膜PRB蛋白全部呈阴性表达，对照组全部呈阳性表达，两组相对表达量差异有统计学意义（p＜0.01）；28例卵巢巧克力囊肿和配对在位内膜PRA蛋白全部呈阳性表达，相对表达量差异无显著意义（p＞0.05），PRB蛋白全部呈阴性表达，相对表达量差异无显著意义（p＞0.05）。2、RT-PCR检测17pHSD 2mRNA结果内异症组28例，对照组15例在位内膜17βHSD 2mRNA全部呈阳性表达，两组差异无显著意义（p＞0.05）；28例卵巢巧克力囊肿17βHSD 2mRNA全部呈阴性表达，与配对在位内膜比较差异显著（p＜0.05）。3、孕激素受体基因内含子G插入306碱基对多态性（PROGINS）结果内异症组66例，对照组56例，等位基因分布频率野生型T1占优势，两组比较（T1／T2和T2／T2与T1／T1相比）OR：4.51[95％CI：1.42-14.34]，P=0.007；两组突变型T2等位基因频率差异显著（0.14与0.04）OR：4.54[95％CI：1.50-13.78]，P=0.004。病例组有2例纯合型T2（3.0％）。4、孕激素受体甲基化模式、免疫组化表达及两者的相关性结果内异症组62例，对照组33例，在位子宫内膜PRA甲基化率分别为39／62和17／33，两组差异无统计学意义（p＞0.05）；PRB甲基化率分别为61／62和22／33，两组PRB的甲基化差异有统计学意义（P＜0.01）。内异症组与对照组免疫组化PRA多数为阳性表达，两组差异无显著性（p＞0.05），但病例组PRB阴性表达率（20／62）高于对照组（2／33），两组差异显著（P＜0.01）。病例组PRB的甲基化与免疫组化PRB的阴性表达相关分析差异显著（P＜0.01）。结论1、子宫内膜异位症患者在位内膜、异位内膜PRB蛋白阴性表达可能与子宫内膜异位症发病有关。2、子宫内膜异位症患者异位内膜缺乏17βHSD 2与子宫内膜异位症发病有关。3、孕激素受体基因内含子G插入306碱基对多态性PROGINS可能与子宫内膜异位症发病有关。4、子宫内膜异位症患者在位内膜CpG甲基化可能与子宫内膜异位症患者PRB基因表达缺失而致病有关。