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隐孢子虫（Cryptosporidium）是一种重要的人兽共患机会性肠道寄生原虫，可感染人、牛、养、猪、猫、犬等260多种动物，能引起宿主自限性腹泻甚至死亡，目前尚无有效防控隐孢子虫病药物和疫苗。目前已鉴定出至少41个隐孢子虫有效种和70多个基因型。在20多种可感染人的隐孢子虫有效种中，研究最多且感染宿主范围广、具显著人兽共患意义的是微小隐孢子虫，在我国流行的微小隐孢子虫优势亚型为Ⅱd亚型。研究报道，隐孢子虫是仅次于轮状病毒的第二大腹泻病原，对人类公共安全构成重大威胁。微小隐孢子虫感染宿主上皮细胞后通过改变其miRNAs的变化实现宿主上皮细胞与微小隐孢子虫之间的相互作用。前期试验证明:微小隐孢子虫感染HCT-8细胞后，TLR2、TLR4等表达水平显著上调，且miRNAs表达谱有显著变化，如Hsa-miR-181d表达水平显著下调。为了解Hsa-miR-181d在微小隐孢子虫和宿主细胞之间中的作用，本试验研究了微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞早期Hsa-miR-181d及TLRs/NF-κB信号通路的相互关系，并对预测的Hsa-miR-181d靶基因即抑制细胞凋亡的Bcl-2进行了验证，以期获取虫体和宿主相互作用的关键分子，为有效药物和疫苗的开发等提供参考。
1.qPCR和Western blotting检测微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞早期TLRs/NF-κB信号通路关键分子如TLR2、TLR4、MyD88和NF-κB的mRNA和蛋白表达。
qPCR和Western blotting检测微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞早期TLRs/NF-κB信号通路关键信号分子mRNA和蛋白的表达水平，结果证实微小隐孢子虫感染HCT-8细胞0h、4h、8h、12h、24h后TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA和蛋白表达水平有显著上调，其中TLR2、TLR4、NF-κB的mRNA和蛋白表达水平均在在8h和24h显著升高，MyD88的mRNA和蛋白表达水平在8h和12h显著升高，表明微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞后通过激活TLR4、MyD88、NF-κB等信号分子激活MyD88依赖型TLRs/NF-κB信号通路，参与防御微小隐孢子虫的感染。
2.qPCR检测微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞早期抑制TLR2、TLR4前后Hsa-miR-181d的变化及流氏细胞仪检测隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞的凋亡情况。
微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞后Hsa-miR-181d在4h、8h、12h的表达水平显著下调，且12h下调极其显著，在48h显著上调。siTLR2、siTLR4转染HCT-8细胞后，Hsa-miR-181d在4h、8h、12h、24h表达水平均上调，在48h表达下调，正好与抑制TLR2、TLR4前的结果呈相反趋势，说明TLR2和TLR4参与调控Hsa-miR-181d的表达。且微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞后，细胞凋亡在12h达到底峰，在48h到达高峰期。以上结果说明:微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞后TLRs/NF-κB信号通路参与调控Hsa-miR-181d的表达，且Hsa-miR-181d与细胞凋亡之间有潜在的相互作用。3.通过双荧光素酶试验初步验证Hsa-miR-181d和预测的靶基因B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)的关系，并转染Hsa-miR-181d的模拟物及抑制剂后通过qPCR和Western blotting从基因和蛋白水平分别检测Bcl-2表达水平。
构建含Hsa-miR-181d潜在靶基因Bcl-2的3UTR的双荧光素酶报告基因野生型载体(pmirGLO-Bcl-2-wild)及其突变型载体（pmirGLO-Bcl-2-mut），初步通过双荧光素酶试验证明Hsa-miR-181d与Bcl-2之间存在潜在的靶向关系;然后使用转染试剂Lipofectamine(R)3000将Hsa-miR-181d的模拟物(mimics)和阴性对照(Negative Control，NC)以及Hsa-miR-181d的抑制剂(inhibitor)及其对应的阴性对照NC共转染HCT-8细胞，qPCR和Western blotting从基因和蛋白水平分别检测Bcl-2表达水平的变化，与mimics NC组相比，miR-181d的mimics组Bcl-2的mRNA和蛋白表达量均显著减少，抑制剂组则正好相反，表明Bcl-2为Hsa-miR-181d的靶基因。
综上所述，微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞后激活MyD88依赖型TLRs/NF-κB信号通路，且抑制TLR2、TLR4前后，Hsa-miR-181d的表水平呈相反趋势，说明TLRs/NF-κB信号通路参与调控Hsa-miR-181d的表达。微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞后，细胞凋亡在12h显著下降，在48h到达高峰期。且Bcl-2为Hsa-miR-181d的靶基因，Bcl-2与Hsa-miR-181d之间存在负性靶向关系。因此，微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞后，激活TLRs/MyD8/NF-κB信号通路，该通路参与调控Hsa-miR-181d的表达，进一步负向调控Bcl-2对细胞的抗凋亡作用，最终导致宿主细胞呈现前期抗凋亡后期促凋亡的双相调节，以此实现抵御微小隐孢子虫的感染。
1.qPCR和Western blotting检测微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞早期TLRs/NF-κB信号通路关键分子如TLR2、TLR4、MyD88和NF-κB的mRNA和蛋白表达。
qPCR和Western blotting检测微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞早期TLRs/NF-κB信号通路关键信号分子mRNA和蛋白的表达水平，结果证实微小隐孢子虫感染HCT-8细胞0h、4h、8h、12h、24h后TLR2、TLR4、MyD88、NF-κB的mRNA和蛋白表达水平有显著上调，其中TLR2、TLR4、NF-κB的mRNA和蛋白表达水平均在在8h和24h显著升高，MyD88的mRNA和蛋白表达水平在8h和12h显著升高，表明微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞后通过激活TLR4、MyD88、NF-κB等信号分子激活MyD88依赖型TLRs/NF-κB信号通路，参与防御微小隐孢子虫的感染。
2.qPCR检测微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞早期抑制TLR2、TLR4前后Hsa-miR-181d的变化及流氏细胞仪检测隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞的凋亡情况。
微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞后Hsa-miR-181d在4h、8h、12h的表达水平显著下调，且12h下调极其显著，在48h显著上调。siTLR2、siTLR4转染HCT-8细胞后，Hsa-miR-181d在4h、8h、12h、24h表达水平均上调，在48h表达下调，正好与抑制TLR2、TLR4前的结果呈相反趋势，说明TLR2和TLR4参与调控Hsa-miR-181d的表达。且微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞后，细胞凋亡在12h达到底峰，在48h到达高峰期。以上结果说明:微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞后TLRs/NF-κB信号通路参与调控Hsa-miR-181d的表达，且Hsa-miR-181d与细胞凋亡之间有潜在的相互作用。3.通过双荧光素酶试验初步验证Hsa-miR-181d和预测的靶基因B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)的关系，并转染Hsa-miR-181d的模拟物及抑制剂后通过qPCR和Western blotting从基因和蛋白水平分别检测Bcl-2表达水平。
构建含Hsa-miR-181d潜在靶基因Bcl-2的3UTR的双荧光素酶报告基因野生型载体(pmirGLO-Bcl-2-wild)及其突变型载体（pmirGLO-Bcl-2-mut），初步通过双荧光素酶试验证明Hsa-miR-181d与Bcl-2之间存在潜在的靶向关系;然后使用转染试剂Lipofectamine(R)3000将Hsa-miR-181d的模拟物(mimics)和阴性对照(Negative Control，NC)以及Hsa-miR-181d的抑制剂(inhibitor)及其对应的阴性对照NC共转染HCT-8细胞，qPCR和Western blotting从基因和蛋白水平分别检测Bcl-2表达水平的变化，与mimics NC组相比，miR-181d的mimics组Bcl-2的mRNA和蛋白表达量均显著减少，抑制剂组则正好相反，表明Bcl-2为Hsa-miR-181d的靶基因。
综上所述，微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞后激活MyD88依赖型TLRs/NF-κB信号通路，且抑制TLR2、TLR4前后，Hsa-miR-181d的表水平呈相反趋势，说明TLRs/NF-κB信号通路参与调控Hsa-miR-181d的表达。微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞后，细胞凋亡在12h显著下降，在48h到达高峰期。且Bcl-2为Hsa-miR-181d的靶基因，Bcl-2与Hsa-miR-181d之间存在负性靶向关系。因此，微小隐孢子虫Ⅱd亚型感染HCT-8细胞后，激活TLRs/MyD8/NF-κB信号通路，该通路参与调控Hsa-miR-181d的表达，进一步负向调控Bcl-2对细胞的抗凋亡作用，最终导致宿主细胞呈现前期抗凋亡后期促凋亡的双相调节，以此实现抵御微小隐孢子虫的感染。