【摘 要】
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背景:虽然使用高效抗逆转录病毒治疗（HAART）可以有效抑制患者体内病毒的复制,但体内的潜伏病毒库无法彻底清除,患者需要长期服药,从而遭受不同程度的药物毒副作用。近年来,具有高亲和力、TCR非依赖性和MHC非限制性等特点的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）免疫疗法成为研究热点,特别在血液肿瘤治疗中取得颠覆性成果。早期有研究通过将天然的CD4分子中的gp120抗原识别区作为嵌合抗原受体胞外域制备C
【基金项目】
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艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治--国家科技部重大专项2017ZX10202102-007；
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背景:虽然使用高效抗逆转录病毒治疗（HAART）可以有效抑制患者体内病毒的复制,但体内的潜伏病毒库无法彻底清除,患者需要长期服药,从而遭受不同程度的药物毒副作用。近年来,具有高亲和力、TCR非依赖性和MHC非限制性等特点的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）免疫疗法成为研究热点,特别在血液肿瘤治疗中取得颠覆性成果。早期有研究通过将天然的CD4分子中的gp120抗原识别区作为嵌合抗原受体胞外域制备CAR-T细胞,杀伤表达HIV-1包膜蛋白的细胞。随着HIV-1广谱中和抗体（b NAbs）的更多发现和深入研究,认识到其高度的靶向性和更宽的覆盖度。目前已开始有研究者将b NAbs作为CAR分子的单链抗体来制备CAR-T细胞,可以特异性的识别多种HIV-1亚型病毒感染的细胞。本研究旨在利用三种HIV-1 b NAbs作为CAR胞外域结构,构建出第三代CAR分子,并使用三代慢病毒包装体系获得CAR慢病毒,进而转导脐血单核细胞（CBMC）,制备并扩增CAR-T细胞。在体外验证其杀伤gp120表达细胞的能力;并构建HIV-1感染小鼠模型,探究CAR-T细胞体内杀伤HIV-1感染细胞的效果。方法:本研究选取HIV广谱中和抗体VRC01,N6和3BNC117的sc Fv序列构建三代CAR质粒,转染293T细胞得到CAR慢病毒,继而转导脐血来源的经CD3/CD28磁珠激活的CBMC分别制备三种CAR-T细胞,在无血清培养基中扩增并检测纯度和转导效率。同时,建立实时无标记细胞功能分析系统检测CAR-T杀伤HIV感染细胞效率的方法。为了检验CAR-T细胞体内杀伤能力,我们静脉注射健康人PBMC到高度免疫缺陷的NPG小鼠体内构建人源化小鼠,再经NL4-Nanoluc病毒感染后成为HIV感染小鼠模型,并利用生物发光成像（BLI）和实时荧光定量PCR对治疗效果进行测定。结果:本研究成功构建含有三种抗HIV b NAbs sc Fv的第三代CAR分子质粒,进一步利用第三代四质粒慢病毒包装系统获得高滴度的CAR慢病毒,转导CBMC培养后CD3+T细胞占总细胞90%,同时获得40%转导效率的CAR-T细胞,在体外进行大量增殖,扩增倍数可达起始细胞总数的66倍。体外杀伤结果表明N6-CAR-T细胞和VRC-CAR-T细胞在10:1效靶比时,可以达到80%以上的杀伤效率。尾静脉注射健康人PBMC到NPG小鼠再注射NL4-Nanoluc病毒感染成功人源化小鼠构建HIV感染小鼠动物模型,静脉回输CAR-T细胞到感染小鼠体内,BLI和QPCR结果表明CAR-T细胞可以有效清除小鼠体内HIV感染的细胞。结论:本研究选取VRC,N6和BNC的sc Fv构建CAR分子;成功包装慢病毒和制备嵌合抗原受体修饰T细胞;并在体外和体内能分别特异性杀伤HIV gp120表达细胞和HIV感染的细胞,显示很好安全性和有效性。考虑到CBMC来源的CAR-T细胞具有低的免疫原性,可以考虑作为通用型CAR-T用于HIV感染者的临床研究。
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