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目的:伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar Typhi,S.Typhi）是造成人类严重食源性疾病的病原体。在病原菌感染人体的过程中,转录因子可通过调节相应基因的表达,抵制宿主细胞的免疫应答,从而适应复杂的人体内环境。Lys R转录调控家族是原核生物中一个重要的转录因子调控家族,可通过调控不同靶基因的表达,影响细菌代谢、毒力、运动性、氧化应激、分泌和耐药等过程。在本研究中,我们通过生物信息学分析发现伤寒沙门菌t0032基因与Lys R转录调节家族同源,但功能未知。因此,本研究拟探讨伤寒沙门菌t0032基因的生物学功能,明确其参与伤寒沙门菌致病的分子机制,拓宽我们对伤寒沙门菌调控网络的认识。方法:1.伤寒沙门菌t0032的表达特性研究（1）提取以A600值为0.3、0.8、1.3、2.0代表的S.Typhi野生株（Wild Type,WT）不同生长时相的总RNA,运用qRT-PCR技术检测t0032转录水平的表达。（2）提取WT对数早期在非应激条件、高渗、酸、氧应激条件下,培养30 min后的总RNA,运用qRT-PCR技术检测t0032转录水平的表达。（3）WT-T0032::3×Flag标签融合菌株的构建:通过pGMB151质粒所介导的同源重组方法,将S.Typhi基因组t0032基因的终止密码子前插入3×Flag基因序列,用于蛋白验证。（4）用Western blot技术,进一步检测t0032蛋白质水平的表达。2.相关菌株的构建（1）t0032缺陷株（Δt0032）的制备:设计并扩增其上、下游片段的特异性引物。将t0032基因组的上下游片段连接并克隆至自杀质粒p GMB151上,利用质粒所介导的同源重组方法构建t0032基因缺陷株（Δt0032）。（2）t0032回补株（Δt0032+pBAD33-t0032）和对照菌株（Δt0032+pBAD33）的制备:将完整的t0032基因编码区克隆至pBAD33质粒,构建pBAD33-t0032重组质粒。分别向Δt0032中电转入pBAD33质粒和pBAD33-t0032重组质粒,构建对照菌株（Δt0032+pBAD33）和t0032回补株（Δt0032+pBAD33-t0032）。3.伤寒沙门菌T0032生物学功能研究:通过比较WT、Δt0032、Δt0032+pBAD33和Δt0032+pBAD33-t0032四种菌株的各种表型差异,分析T0032的生物学功能:（1）生长曲线分析:将各菌株于相同浓度转接至非应激LB液体培养基中,在37℃培养条件下,间隔相同时间记录A600的数值。另将四种菌株分别培养至相同对数生长期,给予酸应激（调节p H至4.5）、高渗应激（300m M Na Cl）、氧应激（高H2O2）,37℃继续培养,间隔相同时间记录A600的数值。以时间和测量数值分别为横、纵坐标,绘制其生长曲线图。分析在上述条件下,T0032对细菌生长的影响。（2）生物膜实验:将各菌株用TSB培养基培养至相同对数期,同时接种至96孔板中,于30℃培养,96 h后经过染色、固定、干燥、溶解,测量孔内液体吸光度的数值,分析T0032对细菌形成生物膜能力的影响。（3）动力实验:将各菌株用LB培养基培养至相同对数期,分别取2μL的菌液垂直加至0.3%LB半固体培养基,在37℃培养8 h后,分别测量菌株动力圈直径,分析T0032对细菌运动能力的影响。（4）上皮细胞侵袭实验:用WT、Δt0032感染上皮细胞,共培养90 min后加入庆大霉素,继续共培养90 min后用0.5%（v/v）Triton X-100充分裂解细胞,并将裂解液涂于LB平板上,次日计数菌落数。（5）药敏实验:将各菌株培养至相同对数期,稀释后涂布于培养基。取出抗生素药敏检测片置于含各菌株的培养基上,37℃培养12 h,测量各菌株抑菌圈直径,根据数值分析在不同抗生素作用下T0032对细菌耐药性的影响。4.T0032调控的机制研究在表型有显著差异的条件下,比较WT、Δt0032、Δt0032+pBAD33和Δt0032+pBAD33-t0032四种菌株靶基因的表达变化,分析T0032调控伤寒沙门菌生物学功能的分子机制:（1）qRT-PCR检测相关功能基因mRNA水平的表达:分别提取不同培养条件下各菌株的总RNA,检测相关基因转录水平的表达差异。（2）La Z融合实验:于四种菌株中电转入含cad C启动子的p HRP309重组质粒,检测β-半乳糖苷酶活性,分析T0032对cad C的启动子的调控作用关系。结果:（1）qRT-PCR结果表明伤寒沙门菌t0032在等渗培养的对数早期转录水平的表达量显著增加。与非应激条件相比,高渗应激条件下t0032的表达量无明显差异;氧应激条件下t0032的表达量上调1.93倍;酸应激条件下t0032的表达量急剧增加,约13.6倍;Western blot结果证实酸应激条件下,t0032的蛋白表达量增加。（2）生长曲线结果表明:在p H=4.5的酸性环境中,与WT相比,Δt0032的生存能力显著降低,回补t0032基因后,生长能力有所恢复。其他条件下,各菌株的生长能力基本无差异。（3）动力和生物膜形成实验结果表明:与WT相比,Δt0032的细菌动力和生物膜形成能力均有所增强,回补t0032基因后,动力和生物膜又恢复至野生株水平。（4）上皮细胞侵袭实验结果表明:与WT相比,Δt0032的侵袭能力显著增强。（5）药敏实验结果表明:与WT相比,Δt0032对氨苄西林和头孢曲松两种抗生素更敏感,回补t0032基因后,药物敏感性又恢复至野生株水平。（6）机制研究中发现,与WT相比,Δt0032中生物膜相关基因cag A、cag D,动力相关基因flj B的表达显著上调。在酸性条件下,耐酸相关基因cad C、fu R、nlp D、rpo S、rcs B的表达则明显降低。（7）La Z基因融合实验表明:酸应激条件下t0032基因能正向调控cad C的启动子活性,促进其转录。结论:T0032可促进伤寒沙门菌的生长,帮助伤寒沙门菌抵制各种不利环境,从而参与伤寒沙门菌的致病。机制研究表明T0032可调控多种基因的表达,其中La Z实验证实T0032可正向调控cad C的启动子活性,促进其转录,参与伤寒沙门菌抵制酸应激。