背景：microRNA(miRNA)是多细胞生物的调控RNA,是一类长度在22nt左右的内源非编码小RNA,广泛存在于动物、植物、病毒等多种有机体中。通过靶向作用于特异：mnRNA的3′UTR,从而抑制翻译过程或直接降解mRNA下调靶蛋白的表达。近50%的人类：miRNA位于染色体脆性区域,而这些区域也多是引发肿瘤的地带。通过大规模平行测序,研究者检测了人正常肝脏、肝炎肝脏、肝硬化和肝癌组织中的：miRNA的表达谱,并由此发现85.9%miRNAs在正常肝脏中低表达,13.2%miRNAs中度表达,而仅有0.9%miRNAs高丰度表达,占整个肝脏miRNA组的88.2%。在肝脏组织中高丰度表达的前9位‘miRNAs中,其中四位均是miR-let-7家族成员。Let-7(lethal-7)是最早发现的miRNA家族之一,2000年第一次在线虫中被发现与靶转录本3′UTR_互_补结合,并鉴定证实。随后被发现在包括从线虫到果蝇以及人的多种组织中序列和功能保守。在人种和鼠种中同线虫中一样,let-7的表达在胚胎发育早期很难检测到,而在分化成熟后的组织表达增高。let-7在许多肿瘤中被发现表达降低,许多研究都将其看作一个抑癌基因,称作抑癌miRNA。相对于正常组织,Let-7在肺癌细胞系和组织标本中均检测到下调表达,且let-7的这种下调表达与癌基因同时也是let-7的靶基因RAS的过表达相关。基于5′端2-8个核苷酸即“种子序列”的保守性,查阅"miRBase(v.l8.0)"(http://www.mirbase.org/search.shtml)发现,人源let-7家族包含11个miRNA "Stem-loop"前体,即hsa-let-7a-1, hsa-let-7a-2, hsa-let-7a-3, hsalet-7b, hsa-let-7c, hsa-let-7d, hsa-let-7e, hsa-let-7f-1, hsa-let-7f-2, hsa-let-7g, hsa-let-7i。加工成熟为17个成熟的miRNA成员即"Mature sequence": hsa-let-7a-5p, hsa-let-7a-3p, hsa-let-7a-2-3p, hsa-let-7b-5p, hsa-let-7b-3p, hsa-let-7c, hsa-let-7d-5p, hsa-let-7d-3p, hsa-let-7e-5p, hsa-let-7e-3p, hsa-let-7f-5p, hsa-let-7f-1-3p, hsa-let-7f-2-3p, hsa-let-7g-5p, hsa-let-7g-3p, hsa-let-7i-5p, hsa-let-7i-3p。所有成员种子序列区高度保守,各个家族成员之间碱基差异微小,因此有人推断,认为各成员平等地发挥等同的作用。然许多研究也提示miRNA3’UTR碱基与靶基因互补几率也是同一家族miRNA发挥不同miRNA的结构基础,甚至可以增强与3’mRNA结合的强度和效率。课题组前期实验检测发现let-7家族成员在肝癌组织中的表达水平并非一致(数据未发表)。其它课题组基因芯片数据也证实这一点。因此我们推测let-7家族成员因其3’UTR碱基序列的差异性,可能会引起生物学功能的不一致。生物体内miRNA存在也多是基因簇(Cluster)的形式。大多数miRNA基于部分互补抑制基因表达,miRNA与肿瘤的作用方式多是“多对一”的方式,即多个miRNA作用于同一个mRNA进而影响肿瘤进展。目的：检测1niR-let-7g/i对肝癌细胞凋亡的诱导作用,并探讨let-7两家族成员之间是否存在交互作用。为miR-let-7治疗肝癌的研究提供理论基础。方法和结果：本课题以1niR-let-7g和miR-let-7i作为研究对象,以肝癌细胞BEL-7402为模型,采用经过甲基化特殊修饰,末端胆固醇标记的miRNA激动剂agomir,上调肝癌细胞中成熟miRNA hsa-let-7g和hsa-let-7i的表达,研究其对肝癌细胞凋亡的影响。1肝癌细胞miR-let-7g和miR-let-7i及其靶基因Bcl-xL内源性表达检测培养肝癌细胞株及正常肝细胞株,同时提取RNA和蛋白,RNA进行逆转录,应用实时荧光定量PCR技术检测细胞内niR-let-7g/i的表达情况；蛋白定量后应用Western Blot检测相应细胞内Bcl-xL的表达。结果显示,相对于正常肝细胞L-02,miR-let-7g/i在肝癌细胞的表达下降,同时其靶基因Bcl-xL上调表达,和miRNA的表达成负相关。2miR-let-7g/i的表达对肝癌细胞凋亡的诱导作用2.1化学合成miRNA agomir的转染利用LipofectamineTM2000将经过特殊化学修饰的miR-let-7g/i agomir和miR-let-7agomir Negative Control转染入肝癌细胞BEL-7402,实验分转染miR-let-7agomir Negative Control组(Ctrl组)、转染miR-let-7g agomir100nM组(1et-7g组)、转染miR-let-7i agomir100nM组(1et-7i组)和共转染miR-let-7g50nM和7i agomir50nM组(1et-7g+7i组)。转染24小时后抽提RNA进行逆转录,运用qPCR法检测转染后肝癌细胞中成熟miR-let-7g和1miR-let-7i的表达。定量PCR结果显示,转染后let-7g组、共转染组let-7g+7i组中miR-let-7g的表达量分别是Ctrl组的2073倍和441倍；let-7i组、共转染组let-7g+7i组中miR-let-7i的表达量分别是Ctrl组的1303倍和605倍。说明let-7g.7i agomir能在细胞内有效稳定高表达成熟let-7g、7i,细胞模型建立成功。2.2EdU检测miR-let-7g/i对细胞DNA复制活性的抑制将肝癌细胞BEL-7402接种接种于96孔板,按以上2.1步骤进行转染,转染48h后EdU标记,细胞固定,Apollo染色,DNA染色,荧光显微镜观测拍照。我们观测到与对照组相比,实验组Hoechst染色,细胞核呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染。应用Image-Pro Plus6.0软件进行细胞计数分析并用SPSS16.0进行析因设计的方差分析,结果显示,相对于对照组,let-7g组与let-7i组DNA复制活性明显下降,相对于let-7i组,let-7g+7i组肝癌细胞DNA复制活性降低,两者存在协同作用,P<0.05。2.3流式检测miR-let-7g/i对细胞凋亡的影响将肝癌细胞BEL-7402接种接种于6孔板,按以上2.1步骤进行转染,转染48h后胰蛋白酶消化,PBS清洗后,收集细胞,加入Binding Buffer悬浮细胞,依次加入Annexin V-FIFC和Propidium Iodide染色细胞。运用流式细胞仪检测。统计学分析结果显示：实验组let-7g、let一7i和let-7g+7i各组中BEL-7402细胞凋亡率分别为14.3%、7.7%和14.1%,与对照组2.2%形成显著差异,P<0.05。Let-7i对肝癌细胞凋亡的诱导作用随let-7g的加入与否而变化,let-7g对let-7i诱导肝癌细胞凋亡的功能具有协同作用,P<0.05。2.4Western B1ot检测miR-1et一7g/i的表达对线粒体凋亡途径相关蛋白的检测将肝癌细胞BEL-7402接种于6孔板,按以上2.1步骤进行转染,转染48h加入细胞裂解液裂解细胞,收集蛋白,进行蛋白定量,Western B10t检测凋亡相关蛋白Bcl-xL.Bak.Bax的表达。检测发现let-7g组和let-7i组中抗凋亡蛋白Bcl-xL的表达没有明显变化,而let-7g+7i组中蛋白Bcl-xL的表达显著下调,P<0.05。同时促凋亡蛋白Bak和Bax都明显表达上调。这表明miRNA let-7g和let-7i通过上调凋亡促进因子Bak和Bax的表达促进肝癌细胞BEL-7402的凋亡。结论：本课题采用经特殊修饰的miR-1et-7g/i agomir转染肝癌细胞BEL-7402,能够在细胞体内稳定高表达成熟miR-let-7g和miR-let-7i,并阻碍肝癌细胞DNA复制活性,抑制肝癌细胞增殖,通过调控凋亡相关蛋白Bcl-xL.Bak.Bax的表达,诱导肝癌细胞凋亡。miR-let-7g对miR-let-7i诱导肝癌细胞凋亡具有协同作用。