HMGB1/NF-κB信号转导通路调控喉鳞状细胞癌浸润与转移的机制研究

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喉癌(laryngeal cancer,LC)是头颈部常见的恶性肿瘤,约占全身恶性肿瘤的5.7%~7.6%,其发病率居头颈部恶性肿瘤的第二位[1],40%患者发现并确诊时已进展为III期或IV期[2]。对于喉癌的治疗,晚期患者不得不以牺牲喉的功能为代价来延长生命,因此早发现早治疗可以有效地提高喉癌患者的生存质量及生存期。目前喉癌的研究已经进入基因水平,现有研究已发现喉癌的发生发展与多种基因密切相关,如EGFR、COX-2、VEGF、STAT3、Ccbe1、Survivin、c-myc、p53、p16、Cyclin D1和Jab1等[3]。HMGB1基因在多种肿瘤中可检测到高表达[4-7],它参与肿瘤发生发展多个过程,其过表达可导致肿瘤细胞的过度增殖及远处转移。目的:通过分析HMGB1基因及其蛋白在喉癌病变组织和喉癌细胞系中的表达模式、siRNA靶向干扰喉癌细胞系中的HMGB1基因、检测基因沉默后喉癌细胞生物学行为的改变,进而探讨HMGB1对于喉鳞状细胞癌增殖、侵袭及远处转移作用的调控机制,尝试探讨HMGB1在喉鳞状细胞癌耐药作用中的调控机制,以期发现预防喉癌发生发展的新靶点。方法:1、采用免疫组织化学方法研究HMGB1蛋白在转移喉鳞状细胞癌、非转移喉鳞状细胞癌中的表达情况,分析HMGB1蛋白表达与喉鳞状细胞临床转移的相关性;2、采用细胞免疫荧光分析HMGB1蛋白在喉癌Hep-2细胞及喉癌Hep-2/v耐药细胞中的表达模式;3、合成HMGB1基因序列的siRNA表达载体,利用脂质体法转染入人喉癌Hep-2细胞和喉癌Hep-2/v耐药细胞系中;4、瞬时转染Hep-2细胞24h后,采用RT-PCR及Western Blot方法分析HMGB1基因及其蛋白表达变化;5、Western Blot方法分析转染后喉癌Hep-2细胞中RAGE蛋白、NF-κB蛋白表达变化,喉癌Hep-2/v耐药细胞系中MDR1蛋白表达变化;明胶酶谱法检测转染前后喉癌Hep-2细胞中MMP-2及MMP-9蛋白活性变化;6、划痕实验检测干扰前后喉癌Hep-2细胞体外迁移能力的改变,平板克隆形成实验检测干扰前后喉癌Hep-2细胞克隆形成能力改变,Transwell实验检测干扰前后喉癌Hep-2细胞迁移及侵袭能力变化;7、CCK8及细胞周期实验检测干扰前后喉癌Hep-2/v耐药细胞系增殖能力变化,Western Blot及细胞免疫荧光实验检测干扰前后喉癌Hep-2/v耐药细胞系HMGB1和MDR1蛋白表达变化。结果:1、全部喉癌标本中HMGB1蛋白表达阳性标本占92.86%,发生淋巴结转移的喉癌标本中阳性表达率为94.44%,未发生淋巴结转移的喉癌标本中阳性表达率为79.17%,两组比较χ2=14.45,P<0.05;2、细胞免疫荧光结果显示HMGB1在Hep-2及Hep-2/v耐药细胞系的细胞核及细胞浆中均有表达,前者以细胞核表达为主,后者细胞浆表达强于细胞核;3、siRNA-hmgb1可抑制喉癌Hep-2细胞中HMGB1mRNA和HMGB1蛋白的表达,抑制率分别达到61.39%和47.69%;4、瞬时转染Hep-2细胞24h后,阳性对照组中RAGE及NF-κB蛋白的表达量较阴性对照组分别下降52.44%(P<0.01)和30.59%(P<0.05);5、瞬时转染Hep-2细胞24h、48h、72h后,阳性对照组表达的MMP-9蛋白活性较阴性对照组下降显著,分别为94.50%、84.71%、66.79%(P<0.01);MMP-2蛋白活性也下降显著,分别为57.96%(P<0.01)、39.25%(P<0.01)及26.34%(P<0.05);6、瞬时转染Hep-2细胞的第2日,6h、12h和24h时,阳性对照组的相对迁移率分别为44.144.48、53.50.58和93.60.39,12h-24h迁移能力下降最明显,与其余两组相比均具有非常显著性差异(P<0.01);7、平板克隆形成实验结果提示阳性对照组细胞克隆数分别为503.0±8.19、317.7±17.82和174.3±4.63,与阴性对照组相比,各接种组别均具有显著性差异;(P<0.05);8、瞬时转染Hep-2细胞24h后,阳性对照组穿膜细胞数为(36.675.24)个/HP,明显低于阴性对照组(128.7023.75)个/HP,两组比较t=3.783,具有显著性差异(P<0.05);9、瞬时转染Hep-2/v细胞24h后,阳性对照组较阴性对照组增殖能力下降20.18%(P<0.01);瞬时转染Hep-2/v细胞48h后,阳性对照组较阴性对照组增殖能力下降21.92%(P<0.05);10、瞬时转染Hep-2细胞24h后,阳性对照组中G1期的细胞比例明显增加,与其他组相比均具有显著性差异(P<0.05),siRNA-hmgb1可将喉癌Hep-2/v细胞有效阻滞在G0/G1期;11、siRNA-hmgb1可以抑制喉癌Hep-2/v细胞中HMGB1和MDR1蛋白表达,抑制率分别达到41.38%(P<0.01)和26.77%(P<0.05)。结论:1、喉癌标本中可见HMGB1蛋白表达,且发生淋巴结转移的喉癌标本HMGB1蛋白表达量显著高于不伴淋巴结转移的喉癌标本,HMGB1蛋白与喉癌的发生发展及远处转移具有一定相关性;2、本研究中,siRNA-hmgb1可抑制喉癌细胞的体外迁移能力及侵袭能力;3、本研究中,siRNA-hmgb1可抑制喉癌细胞的增殖能力;4、本研究中,siRNA-hmgb1可降低喉癌耐药细胞的耐药性;5、本研究中,HMGB1基因可能成为治疗喉鳞状细胞癌的分子靶点。
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