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目的:特发性脊柱侧凸为生长发育期间原因不明的脊柱侧凸,好发于青少年。脊柱侧凸不但可以造成患者脊柱的塌陷、疼痛、以及畸形,严重影响患者的生活质量以及劳动能力,并且对青少年的心理造成严重的创伤。特发性脊柱侧凸的治疗目前主要以手术治疗为主,并伴有术后并发症和明显创伤,因此,需要开发新的治疗方法。研究发现,特发性脊柱侧凸的发生与褪黑激素缺乏有关。应用褪黑素拮抗剂可以提高治疗双足大鼠脊柱侧凸模型的成功率,表明褪黑素缺乏可能增加脊柱侧凸的可能性和严重程度。对青少年特发性脊柱侧凸的前瞻性研究发现,褪黑激素补充剂可以预防脊柱侧凸的进展,特别是在曲线小于35度的轻度病例中。有趣的是,腹腔注射生理浓度的褪黑素并不能阻止特发性脊柱侧凸的发生和发展。然而,腹腔注射褪黑素的浓度远远高于生理浓度,可以预防特发性脊柱侧凸的发生和发展。因此,我们推测高浓度褪黑素可能在特发性脊柱侧凸中起治疗作用。此外,我们团队先前的研究发现,高浓度（1mM或以上）褪黑素抑制成骨细胞的增殖。因此,我们推测褪黑素可以通过抑制成骨细胞的异常增殖和恢复正常的骨生长来阻止畸形的发展。本研究旨在探索褪黑素抑制成骨细胞的增殖的机制。研究方法:1、应用CCK-8试剂检测成骨细胞的增殖能力;2、应用细胞凋亡检测试剂盒检测药物对成骨细胞的凋亡作用;3、应用碱性磷酸酶试剂盒检测药物对成骨细胞分化的影响;4、应用RT-qPCR的实验方法检测目的基因的mRNA水平表达;5、通用免疫荧光显微镜下观察目的蛋白的表达及其细胞内的分布;6、应用蛋白免疫印迹实验技术（Western blotting）检测目的蛋白的表达;7、应用脂质体介导的SiRNA转染下调目的蛋白的表达;8、应用Fluo-4试剂并通过荧光显微镜下观察药物作用成骨细胞后细胞内钙离子的荧光强度;9、应用Fluo-4试剂并用荧光酶标仪检测药物对细胞内钙离子的影响;10、应用JC-1试剂检测线粒体膜电位的变化;11、统计学分析:本文中的所有实验都进行了3次独立的重复,并采用GraphPad软件进行统计分析,采用双侧t检验或单因素方差的分析确定统计学意义,p<0.05具有统计学意义。结果:1、褪黑素以浓度依赖性的方式抑制成骨细胞的增殖、分化并诱导其凋亡。分别用0mM;1mM;2mM;4mM的褪黑素作用成骨细胞48小时,CCK-8结果显示,随着褪黑素浓度的增高,成骨细胞的增殖能力被显著抑制。Cell Death Detection Elisa结果显示,褪黑素以浓度依赖性的方式诱导成骨细胞的凋亡。利用碱性磷酸酶试剂盒检测成骨细胞的分化能力,结果显示,随着褪黑素浓度的增高,成骨细胞的分化能力被显著抑制。2、褪黑素以浓度依赖性的方式抑制成骨细胞的成骨标记物Osteopontin（OPN）;Osteoprotegerin（OPG）;Osteocalcin（OCN）的mRNA的水平表达。分别用0mM;1mM;2mM;4mM的褪黑素培养成骨细胞48小时,利用RT-qPCR的实验方法检测成骨细胞内OPN;OCN;OPG的mRNA水平的表达,结果显示,随着褪黑素浓度的增高,OPN;OCN;OPG的mRNA水平的表达明显降低。3、褪黑素以浓度依赖性的方式上调成骨细胞中基质相互作用分子1（STIM1）和ORAI1的mRNA以及蛋白的表达。分别用0mM;1mM;2mM;4mM的褪黑素培养成骨细胞48小时,利用RT-qPCR的实验方法检测成骨细胞内STIM1和ORAI1的mRNA的表达,结果显示,褪黑素以浓度依赖性的方式上调成骨细胞内STIM1和ORAI1的mRNA水平的表达。利用Western blotting的实验方法检测成骨细胞内STIM1和ORAI1蛋白表达,结果显示,随着褪黑素浓度的升高,成骨细胞内STIM1和ORAI1蛋白的表达明显上调。利用免疫荧光显微镜检测细胞内STIM1的表达以及分布。结果显示,褪黑素可以显著增强细胞内STIM1的表达以及分布。4、褪黑素可以显著增加细胞内钙离子的含量。利用Flou-4检测褪黑素作用成骨细胞钙离子的含量,结果表明,随着褪黑素浓度的增高,细胞内钙离子含量明显增强。5、SiRNA下调STIM1蛋白的表达逆转褪黑素诱导成骨细胞内胞质钙的增高。应用siRNA转染成骨细胞下调STIM1蛋白,结果显示,褪黑素可以增高细胞内钙离子的水平,当siRNA转染成骨细胞下调STIM1蛋白后升高的钙离子被显著抑制,证实了褪黑素通过上调STIM1诱导细胞内胞质钙的增高。6、钙通道阻滞剂TRPC可以逆转褪黑素对成骨细胞增殖的抑制以及凋亡的促进。CCK-8的结果显示应用钙通道阻滞剂TRPC,褪黑素对成骨细胞的增殖抑制以及凋亡的促进作用被有效的逆转,表明细胞内胞质钙的增高是诱导成骨细胞凋亡的关键。7、SiRNA下调STIM1蛋白的表达逆转褪黑素对成骨细胞增殖的抑制以及凋亡的促进。应用siRNA转染成骨细胞下调STIM1蛋白,结果显示,褪黑素对成骨细胞的增殖抑制以及凋亡的促进作用被有效的逆转,证实了上调的STIM1是诱导成骨细胞凋亡的关键。8、褪黑素通过线粒体途径诱导成骨细胞的凋亡。分别用0mM;1mM;2mM;4mM的褪黑素培养成骨细胞48小时,利用JC-1实验方法检测成骨细胞内线粒体膜电位,结果显示,褪黑素以浓度依赖性的方式显著抑制成骨细胞内线粒体膜电位。利用Western blotting的实验方法检测成骨细胞内线粒体凋亡途径蛋白Bax;Bcl-2;Cytochrome C;Caspase3;Cleaved-caspase3蛋白的表达。结果显示,褪黑素以浓度依赖性的方式显著上调Bax;Cytochrome C;Cleaved-caspase3蛋白的表达并下调Bcl-2蛋白的表达。9、SiRNA下调STIM1蛋白的表达可以逆转褪黑素介导的成骨细胞内的线粒体途径的凋亡。用siRNA转染成骨细胞下调STIM1蛋白,并用JC-1检测线粒体膜电位,结果显示,褪黑素降低细胞内线粒体膜电位的水平被显著逆转。同时用siRNA转染成骨细胞下调STIM1蛋白,利用Western blotting的实验方法检测成骨细胞内线粒体凋亡途径蛋白Bax;Bcl-2;Cytochrome C;Caspase3;Cleaved-caspase3蛋白的表达。结果表明,褪黑素介导的成骨细胞内上调的Bax;Cytochrome C;Cleavedcaspase3的蛋白表达显著降低,而降低Bcl-2的蛋白表达显著上调。10、褪黑素显著抑制ERK以及AKT通路的激活。用0mM;1mM;2mM;4mM的褪黑素培养成骨细胞48小时,利用Western blotting的实验方法检测成骨细胞内ERK以及AKT通路的蛋白表达。结果表明,随着褪黑素浓度的增加,ERK以及AKT的磷酸化蛋白被显著抑制。11、SiRNA下调STIM1蛋白的表达可以上调褪黑素介导成骨细胞中ERK磷酸化的表达,而对AKT磷酸化的表达确无明显的影响。应用siRNA转染成骨细胞下调STIM1蛋白,结果显示,被褪黑素的抑制的ERK途径被显著激活,但AKT途径确没有明显的变化。证实了ERK通过参与褪黑素诱导成骨细胞的凋亡。12、钙通道阻滞剂TRPC可以逆转褪黑素对成骨细胞中ERK通路的抑制。应用钙通道阻滞剂TRPC,被褪黑素的抑制的ERK途径被显著激活,进一步证实SOCE通过ERK途径诱导成骨细胞凋亡。结论:1、褪黑素以浓度依赖性的方式抑制成骨细胞的增殖,分化并诱导凋亡。2、褪黑素通过诱导细胞内胞质钙增高并通过线粒体途径诱导成骨细胞凋亡。3、STIM1介导的SOCE是通过ERK途径诱导成骨细胞的凋亡。