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呼吸道感染是全世界最常见的急性疾病之一,而环境低温是诱发各类生物体呼吸系统疾病的重要因素。肺泡巨噬细胞（Alveolarmacrophage,AMs）是定植于肺脏内的巨噬细胞亚群,在维持肺内稳态过程中发挥“屏障”和“前哨”作用。AMs表型是决定其免疫应答方式和强度的“开关”,当受到内源性或外源性刺激后,AMs可极化为M1促炎表型和M2抗炎表型,分泌多种细胞因子,发挥促炎或抗炎功能,以期维持肺脏生理功能的有序进行。那么,冷暴露后AMs会受到怎样的影响呢?其中又有哪些复杂的调控机制呢?为此深入探究冷暴露与AMs表型和功能变化的内在联系,对降低畜禽冷暴露诱发呼吸系统疾病的风险,保障畜禽健康具有重要意义。为了明确冷暴露对于小鼠AMs的表型和功能的影响,本研究首先通过对5周龄的C57BL/6小鼠施加为期5天的,每天8:00-20:00期间随机3h的4℃冷暴露处理。冷暴露周期结束后,采集肺脏和原代AMs。通过ATAC-Seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing,ATAC-seq）、RNA-Seq（RNA Sequencing,RNA-seq）、流式细胞术等方法对AMs的表型和功能进行检测。结果显示,冷暴露后M1型巨噬细胞表面标志物（F4/80,CD86）、蛋白标志物（iNOS）以及相关细胞因子（IL-1β和TNF-α）mRNA表达量均显著升高（P＜0.001）,但吞噬功能显著降低（P＜0.001）。与此同时,肺脏切片结果显示冷暴露后肺脏组织发生炎性细胞浸润。冷暴露后ATAC-Seq峰值的注释基因所富集的生物过程多与炎症因子产生有关,富集的通路多涉及到细胞增殖与糖代谢相关通路。而RNA-seq差异表达基因的基因富集分析结果发现,冷暴露后AMs氧化磷酸化（OXPHOS）途径下调。此外,冷暴露后AMs的氧消耗率（OCR）显著下降（P＜0.001）,胞外动态酸化效率（ECAR）显著升高（P＜0.001）。结果确定了冷暴露诱导小鼠AMs发生代谢重编程,即葡萄糖代谢途径从氧化磷酸化转变为有氧糖酵解,促进AMs发生促炎性极化。沉默调节因子2（SIRT2）是真核细胞内重要的能量感受器,作为一种重要的去乙酰化酶,其可根据细胞内能量代谢变化,通过其去乙酰化功能调控多种转录因子、转录共调节蛋白,将能量代谢变化转化为生物调节信号,参与调控细胞应激反应、代谢和调亡等过程。且前期工作结果显示,乙酰化修饰参与调控冷暴露小鼠海马内小胶质细胞极化,而有氧糖酵解的发生主要在细胞质中。因此,基于上述,为了探究细胞质去乙酰化酶SIRT2是否参与调控冷暴露对小鼠AMs的影响以及如何在其中发挥调控作用,通过免疫印迹、免疫共沉淀串联质谱分析（IP-MS）等技术对小鼠AMs进行检测。结果显示,冷暴露后小鼠AMs中SIRT2的mRNA和蛋白质的表达量均显著下降（P＜0.05）。IP-MS筛选出糖酵解关键限速酶磷酸果糖激酶1（Phosphofructokinase-1,PFK1）可能与SIRT2有潜在相互作用关系,且K614位点发生乙酰化修饰。与此同时,PFK1的蛋白质表达量显著下降（P＜0.001）,但乙酰化修饰水平升高。因此,我们推测SIRT2可能通过干预PFK1的乙酰化修饰调控小鼠AMs的代谢重编程,进而驱动AMs的促炎性极化。为了对上述推测进行验证,基于LPS诱导小鼠肺泡巨噬细胞系MH-S发生M1型极化的研究模型下,通过seahouse细胞呼吸能量代谢分析、免疫共沉淀、免疫荧光等技术系统探究SIRT2介导的PFK1乙酰化修饰对小鼠肺泡巨噬细胞促炎性极化的调控作用及其相关机制。结果显示,SIRT2可参与调控MH-S细胞中IL-1β和TNF-α的mRNA表达量和OCR。同时,SIRT2与PFK1存在互作关系,且通过调控PFK1的乙酰化修饰水平介导其泛素化降解。将PFK1的614位点赖氨酸突变为精氨酸（模拟去乙酰化）后,则消除了 SIRT2对PFK1乙酰化修饰水平的调控作用,并影响PFK1的泛素化修饰,同时缓解了 MH-S细胞中IL-1β和TNF-α的mRNA表达量以及OCR的降低;而将PFK1的614位点赖氨酸突变为谷氨酰胺（模拟乙酰化）后则结果相反。综合以上结果可以确定,SIRT2通过干预PFK1的乙酰化修饰水平介导其泛素化降解,从而调控MH-S细胞的糖代谢途径,进而影响MH-S细胞的极化。接下来,为了进一步验证SIRT2在冷暴露条件下对小鼠AMs表型和功能重要调控作用。我们以SIRT2基因敲除鼠为研究对象,对其冷暴露处理后采集肺脏和AMs,通过靶向糖代谢组学、免疫印迹等方法对上述试验结果进行在体验证。结果表明SIRT2敲除可以促进冷暴露后AMs中PFK1蛋白质表达量的降低,并上调PFK1的乙酰化修饰和泛素化修饰水平。同时,SIRT2缺失加剧了冷暴露后AMs中OXPHOS途径的减弱,加剧了 AMs的促炎性极化。此外,SIRT2缺失加剧了冷暴露后AMs吞噬活性的降低,也加剧了冷暴露后肺脏的炎症反应。由此表明,SIRT2在冷暴露对小鼠AMs表型和功能的影响中具有重要的调控作用。综上所述,冷暴露条件下,SIRT2通过干预PFK1的乙酰化修饰促进其泛素降解,介导有氧糖酵解的发生,促进小鼠AMs的促炎性极化。本研究从免疫代谢角度解析去乙酰化酶SIRT2在冷暴露小鼠AMs促炎性极化中的重要调控作用,为冷暴露容易引发畜禽呼吸系统疾病的机理研究提供了科学依据,对预防冷暴露引起的损伤具有重要的理论意义和实践应用价值。