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目的：炎症因子白介素6（IL-6）在包括糖尿病视网膜病、葡萄膜炎等多种眼科炎症性疾病中起重要作用，可能成为下一个潜在的治疗靶点。视网膜Müller细胞是眼内贯穿视网膜全层的重要细胞，是各种炎症因子分泌的主要来源，对眼内炎症的调节起到了重要作用。然而，视网膜Müller细胞IL-6的表达及其调控机制尚未清楚。本实验目的在于借助于视网膜Müller细胞系（MIO-M1）细胞，深入研究并阐述视网膜Müller细胞IL-6的表达及其调控机制。方法：为找到引起视网膜Müller细胞IL-6表达的最强潜在因素，本实验用不同的刺激：IL-1β（10ng/mL），TNF-α（10ng/mL），IL-6（10ng/mL），IL-8（10ng/mL），VEGF（10ng/mL），IFN-γ（10ng/mL），Glucose（50mM），Mannitol（50mM）处理MIO-M1细胞24h，Western Blot技术检测MIO-M1细胞内IL-6的蛋白改变。为进一步明确IL-1β对视网膜Müller细胞在mNRA水平和蛋白水平对IL-6的调控作用，不同浓度的IL-1β （0,0.1,1,10ng/mL）刺激MIO-M1细胞24h或者IL-1β（10ng/mL）刺激MIO-M1细胞不同时间（0,2,6,12,24h），随后分别用Western Blot技术检测细胞内IL-6的mRNA和IL-6蛋白表达改变。不同浓度的IL-6（0,0.1,1,10ng/mL）刺激MIO-M1细胞24h或者IL-6（10ng/mL）刺激MIO-M1细胞不同时间（0,2,6,12,24h），随后分别用Western Blot技术检测细胞内IL-6的蛋白水平改变。为找到参与调控IL-1β引起的视网膜Müller细胞IL-6的表达的信号转导通路，PPA技术（Protein Pathway Array, PPA）被运用于大范围筛选IL-1β（10ng/mL）处理24h后MIO-M1细胞内的蛋白表达谱改变。同时，IL-1β（10ng/mL）处理MIO-M1细胞不同时间（0,2,6,12,24h），随后用Western Blot技术验证PPA结果。为进一步研究参与IL-1β引起的视网膜Müller细胞IL-6升高的不同信号通路的调控机制，MIO-M1细胞用p38MAPK通路抑制剂（5μM和10μM SB203580），JNK1/2通路抑制剂（5μM和10μM SP600125），ERK1/2通路抑制剂（5μM和10μM U0126），JAK2通路抑制剂（20μM和40μM AG490），NF-κB通路抑制剂（5μM和10μMBAY11-7082）预处理1h，然后用IL-1β（10ng/mL）刺激24h，Western Blot技术检测MIO-M1细胞内IL-6蛋白水平的改变。MIO-M1细胞用p38MAPK通路抑制剂（10μMSB203580），ERK1/2通路抑制剂（10μM U0126）预处理1h，然后用IL-1β（10ng/mL）刺激6h，实时RT-PCR技术检测MIO-M1细胞内IL-6mRNA水平改变。为进一步研究IL-1β调控视网膜Müller细胞IL-6启动子的调控位点，用携带萤火虫酶基因的未突变（pIL-6-Luc651）、NF-κB突变（pIL-6-Luc651△NF-κB）、AP-1突变（pIL-6-Luc651△AP-1）以及C/EBP突变（pIL-6-Luc651△C/EBP）的IL-6启动子质粒，瞬时转染MIO-M1细胞48h后，接着用IL-1β（10ng/mL）处理MIO-M1细胞24h，随后用荧光素酶报告基因技术检测各组荧光素酶活性。为进一步研究p38MAPK通路和ERK1/2通路对视网膜Müller细胞IL-6启动子的调控作用，pIL-6-Luc651启动子质粒瞬时转染MIO-M1细胞48h后，MIO-M1用p38MAPK通路抑制剂（10μM SB203580），ERK1/2通路抑制剂（10μM U0126）预处理1h，然后用IL-1β（10ng/mL）处理24h，随后用荧光素酶报告基因技术检测各组荧光素酶活性。为进一步研究p38MAPK通路和顺式作用元件NF-κB对视网膜Müller细胞IL-6启动子的调控作用，pIL-6-Luc651和pIL-6-Luc651△NF-κB启动子质粒分别瞬时转染MIO-M1细胞48h后，MIO-M1用p38MAPK通路抑制剂（10μM SB203580）预处理1h，然后用IL-1β（10ng/mL）处理24h，随后用荧光素酶报告基因技术技术检测各组荧光素酶活性。结果：与TNF-α（10ng/mL），IL-6（10ng/mL），IL-8（10ng/mL），VEGF（10ng/mL），IFN-γ（10ng/mL），Glucose（50mM），Mannitol（50mM）相比，IL-1β（10ng/mL）引起MIO-M1细胞内IL-6蛋白升高最显著，提示IL-1β是视网膜Müller细胞IL-6升高的潜在刺激因素。IL-1β刺激引起MIO-M1细胞内IL-6mNRA和蛋白升高显著（p<0.001），呈时间和剂量依赖效应。相反，IL-6刺激并引起MIO-M1细胞内IL-1β precursor升高，提示着IL-1β对视网膜Müller细胞IL-6产生的调控具有单向性。PPA技术发现，IL-1β（10ng/mL）处理24h后，MIO-M1细胞内IL-1β precursor、NF-κB p50、p-P38MAPK、p-c-Jun、p-ERK1/2蛋白升高，JAK2、STAT3蛋白降低。同时，Western Blot结果显示IL-1β显著引起p-P38MAPK、p-c-Jun、p-ERK1/2磷酸化增加，IL-1β precursor、NF-κB p50蛋白增加，JAK2、STAT3降低，呈时间依赖效应，结果同PPA一致，提示p38MAPK、JNK1/2、ERK1/2、NF-κB、JAK2/STAT3通路可能参与IL-1β引起的视网膜Müller细胞IL-6升高的调控。随后应用以上不同通路抑制剂，进一步研究各通路对调控IL-1β引起的视网膜Müller细胞IL-6升高的机制，Western Blot技术结果显示p38MAPK，ERK1/2，NF-κB通路抑制剂显著降低IL-1β引起的MIO-M1细胞内IL-6蛋白水平升高，作用效果为p38MAPK抑制剂（SB203580）>ERK1/2抑制剂（U0126）>NF-κB抑制剂（BAY11-7082）。实时RT-PCR结果显示p38MAPK抑制剂（SB203580）和ERK1/2抑制剂（U0126）同时显著降低IL-1β引起的MIO-M1细胞IL-6mRNA升高的水平，作用效果为p38MAPK抑制剂（SB203580）>ERK1/2抑制剂（U0126）。荧光素酶报告基因技术结果显示IL-1β（10ng/mL）引起MIO-M1细胞pIL-6-Luc651启动子活性显著增加，IL-1β+SB203580（10μM）显著降低pIL-6-Luc651启动子的活性，IL-1β+U0126（10μM）组pIL-6-Luc651启动子活性未明显改变，提示IL-6启动子基因-651bp内存在着调控IL-1β引起视网膜Müller细胞IL-6升高的调控位点，而p38MAPK通路通过调控IL-6启动子基因-651bp之内的顺式作用元件参与IL-1β引起视网膜Müller细胞IL-6的升高，ERK通路则可能通过-651bp之外的位点来起作用。未突变及NF-κB或AP-1或C/EBP突变（pIL-6-Luc651,pIL-6-Luc651△NF-κB, pIL-6-Luc651△AP-1, pIL-6-Luc651△C/EBP）的IL-6启动子质粒转染MIO-M1细胞结果显示：NF-κB、AP-1和C/EBP顺式作用元件均参与了IL-1β引起的MIO-M1细胞IL-6启动子活性升高的调控，以NF-κB位点作用最显著。联合应用IL-1β+pIL-6-Luc651△NF-κB+SB203580（10μM），显著降低IL-1β（10ng/mL）引起MIO-M1细胞pIL-6-Luc651启动子活性，抑制作用显著强于IL-1β+pIL-6-Luc651△NF-κB组或者IL-1β+SB203580（10μM）组，提示p38MAPK通路通过调控IL-6启动子基因-651bp之内的顺式作用元件NF-κB参与IL-1β引起视网膜Müller细胞IL-6的升高。结论：本研究首次证实IL-1β主要通过p38MAPK/NF-κB通路激活视网膜Müller细胞IL-6启动子活性，从而调控视网膜Müller细胞IL-6的产生，为视网膜Müller细胞IL-6的调控机制提供新的理论依据，也为将来开发针对IL-6相关眼科疾病的药物开发提供新的思考方向。