论文部分内容阅读
研究背景:特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）是慢性进行性、不可逆性间质性肺疾病,目前病因未明,治疗手段有限,预后极差。近年来研究发现核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族含pyrin结构域蛋白3（NLRP3）炎性小体的持续激活在IPF的发病机制中发挥重要作用。人参皂苷Rb1（ginsenoside Rb1,G-Rb1）作为传统中草药人参中含量最多的活性成分,具有抗炎和抗纤维化作用。已经有研究证实,G-Rb1可以缓解肝、肾纤维化,并可以抑制脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导的急性肺损伤,但G-Rb1能否缓解肺间质纤维化尚未有研究。研究目的:本研究通过体内和体外实验探讨了 G-Rb1是否通过抑制NLRP3炎性小体和上游NF-κB信号通路,进而缓解博来霉素（bleomycin,BLM）诱导的肺纤维化。研究方法:体内实验:1.48只雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组（12只/组）:正常组（control组）、博来霉素模型组（BLM组）、博来霉素+人参皂苷Rb1组（BLM+G-Rb1组）、人参皂苷Rb1组（G-Rb1组）,经气道内滴注BLM构建小鼠肺纤维化模型,每组6只小鼠分别在第3天和第21天安乐死。2.将小鼠肺组织进行苏木精-伊红染色（Hematoxylin-Eosin Staining,HE）、马松（Masson）染色、天狼星红（Sirius Red）染色,进行病理学评估。检测肺纤维化相关指标如 α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin,α-SMA）、胶原 I（collagen I,col I）、羟脯氨酸（hydroxyproline,HYP）,评估各组小鼠肺纤维化程度。3.通过酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay,Elisa）检测肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中细胞因子水平。4.通过western blot检测小鼠肺组织内NLRP3炎性小体相关蛋白和上游NF-κB 信号通路相关蛋白表达。5.通过双重组织免疫荧光,明确NLRP3炎性小体的主要细胞来源。体外实验:1.通过佛波醇 12-十四酸酯 13-乙酸酯（phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA）诱导人急性单核细胞白血病细胞（THP-1细胞）分化为巨噬细胞,使用不同浓度G-Rb1刺激巨噬细胞,使用MTT试剂盒检测不同浓度G-Rb1对巨噬细胞活力的影响,并选取出最合适的G-Rb1浓度。2.构建体外细胞模型,采用LPS和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）刺激巨噬细胞以激活NLRP3炎性小体。将巨噬细胞分为四组:正常组,LPS+ATP组,LPS+ATP+G-Rb1 组,G-Rb1 组。3.通过western blot、real-time PCR检测NLRP3炎性小体相关蛋白的表达情况;通过western blot、细胞免疫荧光检测NF-κB信号通路相关蛋白。4.通过ELISA检测细胞上清中白介素-1β（interleukin-1 beta,IL-1β）和白介素-18（interleukin-18,IL-18）水平。5.收集不同组巨噬细胞的上清液制作条件培养基,将人胚肺成纤维细胞（MRC-5细胞）在不同条件培养基中培养,检测细胞中α-SMA和col I蛋白水平。6.使用重组人 IL-1β（recombinan thuman IL-1 beta,rhIL-1β）刺激 MRC-5 细胞,检测细胞中α-SMA和col I蛋白水平。7.分别使用control siRNA、NLRP3 siRNA转染巨噬细胞后,给予LPS+ATP刺激,通过ELISA检测上清液中IL-1β水平;并制作条件培养基培养MRC-5细胞,观察细胞中α-SMA蛋白表达。研究结果:体内实验结果:1.根据病理学评估,BLM处理后第3天能够引起小鼠急性肺损伤,小鼠肺组织内可见严重肺泡炎症,大量炎性细胞浸润和明显肺水肿。BLM处理后第21天可以导致小鼠肺组织出现纤维化,肺组织结构遭到严重破坏、肺泡结构消失、肺泡间隔明显增厚、成纤维细胞显著增生和细胞外基质异常沉积。G-Rb1干预能够缓解BLM诱导的小鼠急性肺损伤和肺纤维化。2.G-Rb1能够减轻BLM诱导的小鼠BALF中细胞因子如:IL-1β、IL-18、白介素-6（interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor α,TNF-α）和转化生长因子 β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）的释放。（p＜0.01）3.BLM能够诱导小鼠肺组织中NLRP3炎性小体的激活以及下游细胞因子的成熟,并且根据组织免疫荧光结果提示,激活的NLRP3炎性小体主要存在于肺泡巨噬细胞中,G-Rb1干预能够抑制肺泡巨噬细胞中NLRP3炎性小体的激活。4.BLM刺激后可以促进NF-κB p65和IκBα磷酸化以激活NF-κB信号通路,G-Rb1干预能够通过抑制NF-κB p65和IκBα磷酸化阻止NF-κB信号通路的激活。体外实验结果:1.根据MTT结果,我们选取G-Rb1最适宜的浓度为20μM。2.LPS+ATP能够激活巨噬细胞内NLRP3炎性小体,G-Rb1干预能够抑制NLRP3炎性小体的激活。3.LPS+ATP可以激活巨噬细胞内NF-κB信号通路,G-Rb1通过抑制NF-κB p65和IκBα磷酸化以及NF-κB p65入核,进而阻断NF-κB信号通路。4.巨噬细胞中NLRP3炎性小体激活,促进IL-1β成熟和释放,进而诱导肺成纤维细胞分化为肌成纤维细胞,G-Rb1可以抑制巨噬细胞引导的肌成纤维细胞活化。5.rhIL-1β刺激MRC-5细胞,促进细胞内α-SMA和col I蛋白表达。NLRP3 siRNA转染巨噬细胞后,细胞上清中IL-1β水平显著下降;并且使用NLRP3 siRNA条件培养基中的MRC-5细胞内α-SMA水平较control siRNA条件培养基组明显下降。研究结论:1.BLM能够导致小鼠肺组织内大量炎症细胞浸润、肺泡结构破坏、成纤维细胞显著增生以及细胞外基质沉积,引起急性肺损伤和晚期肺纤维化。同时BLM还可以激活肺泡巨噬细胞中NLRP3炎性小体和上游NF-κB信号通路。2.G-Rb1可以延缓BLM诱导的小鼠急性肺损伤和肺纤维化,其机制可能是通过抑制肺泡巨噬细胞中NLRP3炎性小体和上游NF-κB信号通路的激活。3.巨噬细胞可以诱导肺成纤维细胞分化为肌成纤维细胞,主要是通过激活NLRP3-IL-1β通路实现。4.G-Rb1抑制巨噬细胞-成纤维细胞之间的相互作用,其机制可能是通过抑制巨噬细胞内NLRP3炎性小体的激活和下游IL-1β的成熟。