【摘 要】
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大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）是马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）典型成员。SMV自然寄主范围很窄,主要侵染豆科大豆等,近几年研究者相继发现SMV也可侵染天南星科半夏、菊科白术。为研究病毒基因功能和了解SMV突破寄主范围的侵染机制,本试验以半夏和白术为研究材料,采用RT-PCR结合RACE技术,扩增了SMV白术分离物全长基
【基金项目】
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《国家自然科学基金》（NO. 31772130）；
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大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）是马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）典型成员。SMV自然寄主范围很窄,主要侵染豆科大豆等,近几年研究者相继发现SMV也可侵染天南星科半夏、菊科白术。为研究病毒基因功能和了解SMV突破寄主范围的侵染机制,本试验以半夏和白术为研究材料,采用RT-PCR结合RACE技术,扩增了SMV白术分离物全长基因组;通过Gibson快速组装技术构建了SMV-SX突变体和SMV-SXBX基因组全长侵染性克隆。主要研究结果如下:1.基于实验室之前得到山西半夏SMV分离物（SMV-SXBX）全基因组序列,利用Gibson快速组装技术构建SMV侵染性克隆穿梭质粒,同时含有大肠杆菌和农杆菌识别起始位点,可同时在两种细菌中进行表达。我们分两段扩增病毒全基因组,随后将全基因组连入携带35S启动子的p Green II-35S载体上获得重组质粒p Green II-35S-SXBX。将克隆通过农杆菌浸润接种健康半夏后,半夏叶片表现发病症状与野生型SMV一致,RT-PCR检测证实为SMV。2.利用RT-PCR技术和快速c DNA末端扩增技术（RACE）对引起典型大豆花叶病毒病SMV白术分离物（SMV-Am）基因组c DNA进行了克隆和全序列测定,全长9587nt编码一个多聚蛋白,该多聚蛋白含3067个氨基酸,基因组结构分析,SMV-Am具有典型Potyvirus属病毒成员结构特征。多聚蛋白经切割和移码突变后得到11个成熟蛋白,分别为P1、HC-Pro、P3、P3-PIPO、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb和CP,推测其酶切位点分别为Y/S、G/G、Q/A、Q/G、Q/S、E/S、E/S、Q/A、Q/S。进一步将SMV-Am与其他来源的SMV分离物进行核苷酸、氨基酸序列相似性分析,显示SMV-Am与来自大豆SMV分离物Liaoning（SMV-Liaoning）相似性最高,核苷酸和氨基酸相似性分别为96.25%和98.86%。核苷酸系统进化树分析也显示SMV-Am与大豆SMV分离物SMV-Liaoning单独聚为一簇,亲缘关系最近。3.实验室之前成功构建山西大豆SMV分离物（SMV-SX）侵染性克隆。将SMV-SX和SMV-Am核苷酸、氨基酸序列进行相似性比较,发现侵染大豆和白术的SMV基因组结构当中,相似性最低的蛋白为P1蛋白,氨基酸相似性为94.82%,故采用融合PCR技术将SMV-SX和SMV-Am基因组中P1蛋白关键差异区域进行替换,得到SMV-SX突变体克隆。以期为构建突变体侵染性克隆及寻找SMV突破豆科寄主范围侵染菊科植物白术的有关致病因子奠定基础。
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