基于一维过氧化物模拟酶的蛋白质生物传感研究

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酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是利用抗原抗体特异性结合,并采用特殊的标记物对目标蛋白质分子等进行定性或定量分析的最常用方法之一。该方法往往需要抗原或抗体与某种天然酶(例如,辣根过氧化物酶,HRP)连接作为报告基团进行信号放大。然而,天然酶的使用往往存在成本高、制备存储困难、以及易受外界环境变性等不足。无机纳米酶作为一类具有催化功能的模拟酶,由于催化效率高、制备方便、性质稳定等优势,在生物、医学、环境等领域得到广泛应用。这里,我们基于一维无机纳米复合材料的类过氧化物酶活性,构建了比色型生物传感器用于蛋白质超灵敏检测。论文的具体研究内容如下:采用简单溶剂热法合成了一维核壳结构的碳化层包覆四氧化三铁的纳米线(Fe3O4@C NWs),利用透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)等测试手段对其形貌和结构进行了表征分析。选用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)显色体系研究发现,该复合材料表现出优异的类过氧化物酶催化活性,信噪比达到8倍。开展了pH、温度和酶量等催化活性影响因素研究,得到纳米酶催化最佳实验条件。通过稳态动力学实验对其催化机制进行了研究,结果表明该酶对底物H2O2表现出比自然酶HRP和其它类似纳米酶更高的亲和力和催化活性,其米氏常数分别是Fe3O4纳米粒子和HRP的670和17倍,催化动力学为乒乓机理。基于一维Fe3O4@C NWs的类过氧化物酶活性,结合核酸适配体,以血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)为检测对象,构建了三明治结构的纳米酶联适配体吸附测定(nanozyme-linked aptamer sorbent assay,NLASA)的蛋白质分子检测策略。在优化实验条件下,构建的生物传感器实现了对PDGF-BB的超灵敏检测,动态检测范围横跨7个数量级,最低检测至10 fM,并且可通过肉眼直接观察到不同目标物浓度的底物溶液颜色变化。为了进一步提高传感器灵敏度,将富含鸟嘌呤(G)的四螺旋结构DNA(G4)与氯化血红素(hemin)复合的G4/hemin DNA酶修饰在Fe3O4@C NWs表面,在二者杂合酶协同催化作用下,检测限进一步降至50 aM。此外,该传感器实现了50%人血清模拟样品低至100 fM的可视化检测,展示了在临床检测的潜在应用。基于三种一维无机纳米复合材料的类过氧化酶催化活性,构建了蛋白质阵列传感器。制备了三种不同一维无机纳米材料(PPy@MoS2@Pd、PPy@MoS2@Au和PPy@MoS2@Ag),通过SEM等对其进行了测试表征分析,并且对不同材料的类酶催化活性、影响因素和催化机理进行了研究分析。选取了具有代表性的8种不同蛋白质分子,基于蛋白质分子与三种不同类过氧化物纳米酶的相互作用,研究了蛋白质分子对不同纳米酶的催化活性影响,初步构建了蛋白质阵列传感器。
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