支气管哮喘（简称哮喘）是世界上最常见的慢性疾病之一,全球约有4亿哮喘患者,占不同国家总人口的1-18%,且发病率仍然在逐年升高。哮喘患者表现为反复发作的喘息、气急、胸闷、咳嗽,并伴有可逆的气流受限,其中超过半数是由过敏原诱发的2型辅助性T细胞（TH2）主导的2型免疫反应。哮喘急性发作的预测危险因素和生物标志物是嗜酸性粒细胞计数升高。嗜酸性粒细胞是由造血干细胞（HSC）经过嗜酸性粒细胞分化谱系,在骨髓中发育成熟。在过敏性哮喘中,成熟嗜酸性粒细胞被募集到肺炎症部位,并释放一系列细胞因子、趋化因子或颗粒蛋白等,参与介导气道炎症的病理反应。直接靶向嗜酸性粒细胞分化,是控制哮喘临床症状、减轻病情加重的有效治疗策略。趋化因子是一类小分子分泌型蛋白,趋化因子的受体均为G蛋白偶联受体（GPCR）,二者相结合后广泛参与免疫细胞应答、迁移等各种免疫过程。哮喘炎症中已知的重要趋化因子包括嗜酸性粒细胞趋化因子配体CCL11（也称为Eotaxin-1）及其受体CCR3等,但目前关于靶向趋化因子及受体的临床研究并未达到预期效果,因此继续探究调控哮喘免疫反应的关键趋化因子,有望为哮喘的靶向治疗提供更多方向和依据。小鼠CCL6（m CCL6,也称为C10）和人CCL15（也称为MIP-5,MIP-1δ）、CCL23（也称为MPIF-1）是属于同类亚家族的趋化因子,在多种疾病中发挥重要的免疫调控作用,包括肺纤维化、变应性支气管肺曲菌病等。小鼠CCL6与人CCL15和CCL23一样,被报道受体为CCR1,但缺乏直接的实验证据。本团队前期的研究表明,小鼠嗜酸性粒细胞通过分泌趋化因子CCL6破坏卵清蛋白（OVA）哮喘模型中的HSC稳态,但是m CCL6在过敏性气道炎症中所发挥的具体作用及机制尚不清楚,h CCL15和h CCL23在哮喘患者中的作用仍有待进一步的探索。目的明确哮喘中趋化因子h CCL15、h CCL23和m CCL6的表达水平以及分泌来源,并分析其与哮喘疾病的相关性。探究m CCL6在哮喘病理过程中的作用及机制,并阐明m CCL6与受体CCR1的相互作用。探讨靶向CCR1对过敏性气道炎症的影响,为哮喘防治提供新的靶点。方法1.检测哮喘病人和哮喘模型小鼠中h CCL15、h CCL23和m CCL6的表达,分析其与嗜酸性粒细胞的相关性,并用流式细胞术、免疫荧光等方法确认其分泌来源。2.构建Ccl6基因敲除（Ccl6-/-）小鼠,并建立OVA诱导的哮喘模型,用免疫组化、免疫荧光、流式细胞术等方法,分析m CCL6敲除对哮喘模型中的嗜酸性粒细胞水平、肺部炎症水平、TH2免疫反应和骨髓嗜酸性粒细胞分化谱系的改变。3.用Glo Sensor实验鉴定CCR1是否为m CCL6的受体,并用CCR1的不同N端截短体,检测m CCL6和h CCL15的激活效率变化。Western blot检测CCR1激活后下游MAPK信号通路磷酸化蛋白水平变化。流式细胞术检测骨髓干祖细胞膜上的CCR1表达,在体内OVA哮喘模型或体外m CCL6干预后的改变。4.用CCR1抑制剂BX471和Ccr1基因敲除（Ccr1-/-）小鼠进行骨髓嗜酸性粒细胞分化（BMDE）体外实验,评估CCR1对嗜酸性粒细胞分化的影响。利用WT和Ccr1-/-小鼠的骨髓细胞分别对受体鼠做全骨髓移植和竞争性骨髓移植重建,在此基础上建立OVA诱导的哮喘模型,分析不同来源骨髓细胞中嗜酸性粒细胞分化谱系的改变。最后,在哮喘模型中应用BX471,检测CCR1抑制剂对哮喘过敏性气道炎症的治疗效果。结果1.哮喘患者血浆中高表达h CCL15和h CCL23,且主要由嗜酸性粒细胞分泌。小鼠哮喘模型中肺泡灌洗液（BALF）上清、肺组织和外周血中的m CCL6升高,也主要来自于嗜酸性粒细胞。OVA诱导的哮喘模型中,嗜酸性粒细胞分泌的m CCL6增多,其中IL-5通过MAPK通路能够促进嗜酸性粒细胞分泌m CCL6。2.Ccl6-/-小鼠除m CCL6缺失外无其他生理改变,但m CCL6缺失显着降低了OVA诱导的嗜酸性粒细胞增多,并缓解了过敏性气道炎症、黏液高分泌及TH2免疫反应,抑制OVA诱导的骨髓嗜酸性粒细胞分化增强。同时,m CCL6缺失还会影响嗜酸性粒细胞向气道炎症部位的募集。3.m CCL6可以直接激活CCR1,且该过程依赖于CCR1的N端结构。m CCL6激活CCR1后,其下游信号G蛋白通路和β-arrestin通路也被激活,表现为ERK1/2和p38蛋白磷酸化增加、CCR1膜蛋白发生内化。小鼠骨髓干祖细胞上的CCR1,在体内OVA模型中和体外干预m CCL6后均发生内化,嗜酸性粒细胞上的CCR1也被激活。4.CCR1抑制剂BX471显着降低了嗜酸性粒细胞在体外的分化,在体内OVA哮喘模型中则抑制了肺嗜酸性粒细胞浸润,缓解过敏性气道炎症。进行骨髓移植重建后,在OVA诱导的炎症环境中,CCR1缺失的干祖细胞与正常的干祖细胞相比,向嗜酸性粒细胞分化的能力被显著削弱。结论在哮喘患者和哮喘模型小鼠中,嗜酸性粒细胞分泌的趋化因子h CCL23和h CCL15及其同源物m CCL6均显著增加。m CCL6与受体CCR1相互作用,促进炎症环境下嗜酸性粒细胞的分化,构成哮喘加重的正反馈循环。为嗜酸性粒细胞参与哮喘气道炎症调控提供新的机制,揭示了阻断m CCL6-CCR1信号轴可以作为治疗过敏性气道炎症的潜在靶标。