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研究背景:肺癌已逐渐成为威胁人类健康的恶性肿瘤之一,其发病率与死亡率逐年增加,已跃至癌症死亡率的首位,其中非小细胞肺癌已占所有肺癌病例的80%以上。肺癌的治疗多以手术、放疗、化疗等为首要的方式,但对于一些中晚期肺癌患者,往往已经失去了手术治疗的机会,与此同时,放化疗既具有较严重的副反应,又容易出现放化疗抗性而最终导致治疗失败,从而极大的限制了肺癌患者的治疗,导致其预后非常差,致使肺癌患者五年存活率仍低于15%。环磷酰胺是一种传统的抗肿瘤化疗药物,其在非小细胞肺癌患者的治疗中广泛应用,它通过干扰DNA功能,与其发生交叉联结,抑制DNA合成等机制杀灭肿瘤细胞,但是环磷酰胺是非特异性的化疗药,其在杀伤肿瘤细胞的同时也损伤正常细胞,致使机体免疫功能下降,免疫监视功能降低,加速肿瘤细胞逃亡、存活及增殖,最终导致治疗失败。中医中药在抗肿瘤细胞生长与转移、增强化疗疗效与降低化疗毒性、提高患者免疫功能、改善患者症状以及提高患者生存质量等方面有其自身的优势。蝎毒多肽提取物便是本实验室从东亚钳蝎蝎毒中提取并纯化的有效抗肿瘤中药成分,其为含50～60个氨基酸的多肽混合物,它是一种耐热、pH稳定的蛋白质,相对分子质量为(6～7)×103,具有多种生物活性。当前研究证实,蝎毒多肽提取物在体内外均具有显著的抗肿瘤作用,其可改善荷瘤机体的免疫功能状态,并能与放化疗联合应用产生良好的协同抗肿瘤效应,但是目前蝎毒多肽提取物的抗肿瘤细胞机制尚未完全阐明。因此本实验通过观察蝎毒多肽提取物联合环磷酰胺对Lewis肺癌细胞免疫逃逸相关因子的影响,探讨蝎毒多肽提取物联合环磷酰胺抗肿瘤细胞的机制。目的:观察蝎毒多肽提取物(PESV)联合环磷酰胺(CTX)对肿瘤微环境中细胞因子TGF-β1、VEGF、PCNA的表达及对树突状细胞(DC)分化成熟的影响。进而揭示PESV抗肿瘤作用的机制,为非小细胞肺癌患者(NSCLC)中西药联合治疗提供实验依据。方法:1.建立Lewis肺癌小鼠皮下荷瘤模型,随机分为荷瘤对照组、化疗(CTX)组、PESV组和实验组(CTX+PESV组)。记录肿瘤生长曲线,测量肿瘤体积并计算抑瘤率,观察PESV对肿瘤生长的抑制作用。2.常规HE染色,光镜下观察瘤组织病理变化。3.免疫组化法检测瘤组织中血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子β1(TGF-β1)、增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。4.逆转录PCR检测瘤组织中血管内皮生长因子(VEGF-A)、转化生长因子β1(TGF-β1)5.免疫荧光化学法检测瘤组织中浸润的DC表面共刺激分子B7-1、B7-2的表达。6.免疫荧光化学法检测瘤组织中浸润的DC表面分子B7-1和MHC classⅡ、B7-2和MHC classⅡ的共表达结果:1.药物干预对Lewis肺癌的影响干预21d后,与荷瘤对照组相比较,PESV组、化疗组和实验组的小鼠体内Lewis肺癌生长均受到抑制,其抑制率分别为31.57%、47.32%、53.63%(P<0.05)。2. PESV对小鼠Lewis肺癌瘤体中TGF-β1、VEGF、PCNA表达的影响TGF-β1、VEGF的棕黄色阳性表达颗粒主要分布于肿瘤细胞胞质中,PCNA棕黄色阳性表达颗粒主要分布于细胞核内。其中荷瘤对照组阳性表达率最高,表达+ + +以上者高达80%;CTX组和PESV组阳性表达率次之,表达+ + +以上者为60%;而实验组的阳性表达率仅为30%。实验组与荷瘤对照组相比较差异非常显著(P < 0. 01)。3.瘤组织中DC表型B7-1、B7-2检测荧光显微镜下观察,绿色荧光信号代表阳性表达。与荷瘤对照组相比较,PESV组中B7-1、B7-2的绿色荧光信号强度有所增强;化疗组中绿色荧光信号强度有所下降,而实验组中荧光信号表达强度与化疗组相比,强度和表达量均有所增加。4.瘤组织中DC表型B7-1和MHC classⅡ、B7-2和MHC classⅡ双标检测明亮的绿色荧光信号代表B7-1、B7-2表型阳性;明亮红色荧光信号代表MHC classⅡ表型阳性;黄色荧光信号代表B7-1和MHC classⅡ或B7-2和MHC classⅡ双阳性。荧光显微镜下观察,各组瘤组织中均有B7-1和MHC classⅡ、B7-2和MHC classⅡ的双阳性表达存在,与荷瘤对照组相比较,PESV组黄色荧光信号有所增加;化疗组中黄色荧光信号有所下降,与化疗组相比,实验组中黄色荧光信号的强度和表达量均有所增加。5. PESV对小鼠Lewis肺癌瘤组织中TGF-β1和VEGF-A mRNA表达量的影响与荷瘤对照组相比,PESV组和化疗组中TGF-β1和VEGF-A的mRNA表达量均降低(P均<0.05);与PESV组和化疗组相比,实验组中TGF-β1和VEGF-A的mRNA表达量均降低(P<0.05)。结论PESV可抑制Lewis肺癌中TGF-β1、VEGF和PCNA的表达,促进DC的成熟,恢复其抗原摄取提呈功能,逆转CTX对机体的免疫损伤,从而起到诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖的作用。