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前言胰腺癌是一种发生发展极为迅速的消化系肿瘤,近年来发病率及死亡率逐年提高。现代医学治疗肿瘤的常用方法如放化疗、靶向治疗等均效果不满意。临床观察发现加味乌梅丸(JWWMW)对胰腺癌具有一定的效果。前期实验证实加味乌梅丸可抑制裸鼠人胰腺癌皮下移植瘤的生长,抑瘤率低于化疗药吉西他滨,与吉西他滨联合应用有协同抑瘤作用。本实验拟采用移植瘤体积、抑瘤率、肿瘤细胞凋亡率等指标研究加味乌梅丸的最佳抑瘤剂量,并采用比较蛋白组学探寻加味乌梅丸抑制胰腺癌的机制,力图找到其抑制胰腺癌的作用靶点及通路,为临床治疗胰腺癌开拓新思路。方法1. NOD/SCID小鼠人胰腺癌SW1990细胞移植瘤模型建立,分为模型组、加味乌梅丸低剂量组、加味乌梅丸中剂量组、加味乌梅丸高剂量组4组。具体给药如下：A组(模型组)：分组后每只每日灌胃无菌注射用水0.4mlB组(加味乌梅丸低剂量组)：分组后每只每日灌胃0.4g生药/0.4mlC组(加味乌梅丸中剂量组)：分组后每只每日灌胃0.8g生药/0.4mlD组(加味乌梅丸高剂量组)：分组后每只每日灌胃1.6g生药/0.4ml2.分组后,每5天测量瘤径一次,并计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线图。3.给药20天后取材,剥离瘤体,天平测量瘤块重量,称重小鼠剥离瘤体后体重,计算抑瘤率。4.流式细胞仪检测细胞凋亡5.TUNEL法(DNA断裂的原位末端标记法)检测胰腺癌细胞凋亡6.运用基于TRAQ技术的比较蛋白组学对四组移植瘤样本进行差异蛋白分析及质谱鉴定。将置信度在95%以上,与模型组相比上调或下调1.5倍以上,unique Peptides两条以上,定量次数大于等于3的蛋白定义为显著差异蛋白。7.对差异蛋白进行GO注释,KEGG代谢通路分析,分析差异蛋白的细胞定位、分子功能和生物过程,所涉及的代谢通路。8.运用蛋白免疫印迹及免疫组化两种方法对差异蛋白进行再验证,证明蛋白组学结果的可靠性。结果1) NOD/SCID小鼠人胰腺癌SW1990细胞移植瘤造模成功。2)实验过程中,灌胃至第15天时,高剂量组已相继有3只小鼠出现死亡,故D组数据缺失。3)7d时(刚成瘤)各组瘤体积无明显差异(P>0.05),随着时间的延长,各组肿瘤体积明显增大,但C组(中剂量组)移植瘤的体积的增长幅度明显小于其余各组,与A组(模型组)相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。取材时C组(中剂量组)移植瘤体积最小,与A组(模型组)相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。4)分组时各组小鼠体重差异无统计学意义(P>0.05),各组之间具有可比性；给药20天取材,减去肿瘤重量后各组小鼠体重比较无显著性差异(P>0.05)5)A组移植瘤重为(0.97±0.14)g, B组移植瘤重为(0.96±0.24)g,C组(0.76±0.18)g。与A组(模型组)相比,C组(中剂量组)及B组(低剂量组)瘤重均小于A组,其中C组与A组相比差异具有统计学意义(P<0.05),抑瘤率为22%。B组瘤重与A组相比略有减小,差异无统计学意义。6)流式细胞仪检测结果示ABC三组早期凋亡率(%)分别为17.02±2.75、24.03±1.70、29.68±0.76,中剂量组早期凋亡率最高,约30%,远高于其他两组,与其他两组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。7) TUNEL检测法检测结果示ABC三组凋亡指数(%)分别为19.2±7.4、48.3±11.3、59.4±19.3,各治疗组肿瘤组织的凋亡率均显著高于模型组(P<0.01),其中中剂量组凋亡指数最高。8)用基于TRAQ技术的比较蛋白组学方法鉴定差异蛋白。我们将抑瘤效果较好的C组即加味乌梅丸中剂量组与模型组进行比较,共得到上调或下调1.5倍以上蛋白即差异蛋白56种。在此基础上鉴定uniq ue peptide两条以上、定量次数较多(大于等于3)的蛋白17种,与模型组相比下调的蛋白15种,上调2种,涉及细胞骨架相关蛋白、肿瘤营养供应相关蛋白、效应因子、微量元素等。9)GO分析结果显示差异蛋白细胞组分主要为细胞零件(cell part),细胞(cell);分子功能主要为结合整合(binding),催化活性(catalytic activity);生物学过程主要为细胞过程(cellular process)、代谢过程(metabolic process)。10) KEGG富集分析结果显示差异蛋白涉及的代谢通路主要与机体营养物质合成代谢相关；细胞信号通路传导；细胞骨架相关蛋白相关。11)蛋白免疫印迹及免疫组化对部分差异蛋白进行再验证,C组(加味乌梅丸中剂量组)中肌球蛋白调节轻链2(MYLII)、碳酸酐酶3(CAIII)这两个蛋白表达低于A组(模型组),而高迁移率蛋白17(HMG-17)在C组(加味乌梅丸中剂量组)的表达高于A组(模型组),与蛋白组学的研究结果相一致。结论1)加味乌梅丸单用即有抑制胰腺癌sw1990细胞移植瘤的作用,以相当于成人临床用量的中剂量组效果最好,抑瘤率可达22%,低剂量组次之,高剂量组具有一定毒性。乌梅丸加味很可能是通过诱导胰腺癌细胞早期凋亡而发挥抑瘤作用。2)加味乌梅丸通过下调肌浆球蛋白调节轻链2 (MLCII)、肌质、肌浆/内质网钙ATP酶(sarcoplasmic/endoplasmic reticulumcalcium ATPase)、碳酸酐酶3(CAIII)、脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(FABP4)4个差异蛋白表达,并上调硒结合蛋白(selenoprotein)、高迁移率蛋白17(HMG-17)2个差异蛋白表达来发挥抗肿瘤作用,我们推测这6个蛋白即为加味乌梅丸的作用靶点。3)差异蛋白分子功能主要为结合整合(binding)、催化活性(catalytic activity);涉及生物学过程主要为细胞过程(cellular process)、代谢过程(metabolic process)。涉及的KEGG通路主要为氮代谢通路(Nitrogen metabolism)、精氨酸和脯氨酸代谢通路(Arginine and proline metabolism)、激活受体信号通路(PPAR signaling pathway)、钙信号通路(Calcium signaling pathway)。4)蛋白免疫印迹及免疫组化结果证实蛋白组学结果是可靠的。