研究目的和背景:犹素（ubiquitin-fold modifier 1,UFM1）是一种类泛素蛋白。与泛素一样,犹素可以共价结合到其靶蛋白上,这种现象称为犹素修饰（ufmylation）。已有研究发现犹素的两种特异性蛋白酶UfSP1（Ufm1-specific protease 1）和 UfSP2（Ufm1-specific protease 2）不仅可以对犹素的前体形式进行酶切作用,暴露其C末端的甘氨酸,使其变为成熟的犹素后在细胞中发挥作用,还能逆转底物蛋白的犹素修饰。由此可见UfSP1/UfSP2对犹素系统十分重要。近年来研究表明,犹素修饰系统与许多疾病的发生发展有关,比如癌症、血液系统疾病、神经系统疾病、炎症、软骨发育缺陷等。而犹素在这些疾病中的调控机制尚不明确,有可能与犹素的底物蛋白有关。但是在该修饰系统中仅发现了少量的底物,包括犹素结合蛋白 1（UFM1 binding protein 1,UFBP1）,activating signal cointegrator 1（ASC1）,60S ribosomal protein L26（RPL26）和 Histone H4。而近几年发现的犹素底物蛋白都与UfSP2有关。据文献报道,UfSP2和ASC1、RPL26相互作用,且只有当敲低或敲除UfSP2时才能检测到它们的犹素修饰。目前UfSP1/UfSP2的功能尚不明确,且人源UfSP1没有水解酶活性,预示着它们可能还有其他的功能。因此我们想通过鉴定UfSP1/UfSP2相互作用蛋白来探索UfSP1/UfSP2潜在的生物学功能,从而更深入地认识犹素修饰系统。研究方法:一方面,使用TurboID标记邻近蛋白的方法鉴定与UfSP1/UfSP2相互作用的蛋白。首先,用蛋白质印迹优化了 TurboID催化生物素修饰的实验方法;其次构建了带有TurboID的UfSP1/UfSP2融合蛋白,然后在HEK293T细胞中分别表达对照和这两个蛋白,加生物素处理,随后通过生物素-中性亲和素亲和纯化生物素标记蛋白,通过免疫印迹法验证,再用质谱定量分析获得的UfSP1/UfSP2相互作用蛋白。通过亲和纯化、免疫印迹和免疫荧光共定位验证这些蛋白与UfSP1/UfSP2的相互作用,结合相互作用蛋白的生物信息学分析探索UfSP1/UfSP2的功能。另一方面,为了探索UfSP2在犹素系统中的功能,我们构建了敲低UfSP2的稳转细胞株。通过免疫印迹法探索UfSP2对犹素修饰的影响。研究结果:首先,优化了 TurboID催化生物素修饰实验条件,使用50 μM生物素孵育10分钟可以有效地实现蛋白生物素标记。构建了 TurboID-UfSP1/TurboID-UfSP2融合蛋白,转染HEK293T细胞、生物素处理、亲和纯化后通过免疫印迹实验发现与对照组TurboID相比,实验组有明显的特异性条带。对纯化后的样品进行质谱分析,发现有40个和16个高可信度的蛋白分别与UfSP1/UfSP2相互作用。对这些相互作用蛋白进行生物信息学分析,发现它们主要参与内质网中的蛋白质加工、吞噬体和致病性大肠杆菌感染相关通路,预示着UfSP1/UfSP2可能参与这些过程的调控。在这些相互作用蛋白中,发现SQSTM1/p62、RBM14等有重要功能的蛋白。随后通过亲和纯化与免疫印迹法验证了 UfSP1与p62的相互作用,但UfSP1/UfSP2不调控p62的蛋白水平,LC3蛋白表达也不受UfSP1/UfSP2影响。通过免疫荧光实验发现UfSP1与p62有共定位且UfSP1对p62聚集体有调控作用。敲低UfSP2后,犹素修饰的蛋白水平有所上升。研究结论:通过邻近生物素标记技术与定量蛋白质组学分析,鉴定了与UfSP1/UfSP2相互作用的蛋白,其中包括p62、RBM14等在细胞中具有重要功能的蛋白。这些相互作用蛋白参与内质网中的蛋白质加工、吞噬体和致病性大肠杆菌感染相关通路。免疫荧光发现UfSP1与p62共定位,且能增加p62聚集体,预示UfSP1可能参与蛋白质聚集的形成。敲低UfSP2会使犹素修饰增加,说明UfSP2调控犹素修饰蛋白水平,这一方法可能可以用于对犹素修饰蛋白的鉴定。