无论是对动脉瘤的发生、复发、破裂及愈合修复过程,还是对动脉瘤的病因都还知之甚少。颅内动脉瘤破裂是蛛网膜下腔出血的主要原因,致死、致残率高,并发症严重,目前传统手术夹闭和血管内介入治疗是颅内动脉瘤的主要治疗方式,还缺少药物治疗的方法,传统手术和血管内介入治疗均是动脉瘤发生后的治疗,其中介入治疗部分利用机体自身的愈合机能使得动脉瘤愈合,减少出血的发生,血管内介入治疗已从单纯栓塞动脉瘤向完成载瘤动脉重建的方向发展,支架的发展为载瘤血管重建提供了基础,对载瘤动脉的血管重建过程需要深入研究。最理想的血管重建是血管壁薄弱和缺损的部分被完全的结构和功能的重建,针对血管内膜来说希望有完全的内皮结构和功能重建。另外,血管内膜(包括内皮)的修复被认为与动脉瘤的复发、再生甚至动脉瘤的病因有关,完全的内膜重建理论上可以减少动脉瘤的复发再生。有研究证实提高内皮细胞的功能可以减少动脉瘤的发生。一直认为内皮修复是通过邻近血管内皮细胞增殖、迁移完成的,内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells ,EPCs)的发现,为动脉瘤的研究提供新的线索,在球囊损伤的动物模型及动脉粥样硬化的研究中发现EPCs可以转化为内皮细胞参与内皮的修复。EPCs、EPCs的数量及功能的不足与颅内动脉瘤发生是否有关,是否参与血管重建修复还未见有研究报道,本研究目的是为了明确EPCs是否与动脉瘤的修复有关,通过从骨髓获取单个核细胞,诱导分化获取EPCs,利用干细胞示踪技术、兔弹力酶诱导的动脉瘤模型及新型血流导向支架(Tubridge),探索EPCs是否参与动脉瘤形成过程中的修复及是否参与支架治疗后的血管内膜的重建。一、扩增骨髓来源的内皮祖细胞及其鉴定摘要目的用Ficoll梯度离心的方法分离兔骨髓中的单个核细胞,并用用EGM-2培养基体外培养,诱导分化,获取EPCs,观察EPCs扩增能力,同时对获取的细胞进行鉴别。方法新西兰大白兔10只,每只兔骨髓穿刺抽取骨髓3ml,用Ficoll梯度离心的方法分离兔骨髓中的单个核细胞,用EGM-2培养基对获取的单个核细胞进行培养、诱导分化,观察细胞生长及形态变化,绘制细胞生长曲线评估扩增能力。培养12天后的贴壁细胞行CD133、CD34、VEGFR-2抗原细胞免疫组织化学鉴定及吞噬乙酰化低密度脂蛋白(ac-LDL)和结合荆豆凝集素(UEA-1 lectin)的内皮细胞功能鉴定。同时对贴壁生长12天后的细胞行CD133免疫磁珠分选及流式细胞仪检测,比较分选前后的CD34+/VEGFR-2+和CD133+/CD34+/VEGFR-2+细胞比例的变化。结果Ficoll梯度离心的方法分离兔骨髓中的单个核细胞培养48 h后可见细胞呈丛状或集落样生长,细胞呈梭形、三角形、多边形,细胞生长曲线呈“S”型。经过12天的培养,每3 ml可以获得(1.46±0.13)×106个贴壁生长的EPCs,细胞呈铺路石样外观, CD133、CD34、VEGFR-2抗原阳性表达,具有吞噬ac-LDL和结合UEA-1 lectin的内皮细胞功能。经CD133免疫磁珠分选后CD34+/VEGFR-2+和CD133+/CD34+/VEGFR-2+的细胞比例数分别为分选前的3.38倍和6.14倍。结论可以通过Ficoll梯度离心的方法分离兔骨髓中的单个核细胞,经培养、诱导分化的方法方便快捷的获取EPCs。二、内皮祖细胞参与修复兔动脉瘤的示踪研究摘要目的对动脉瘤的病因、发生发展及破裂过程还知之甚少,推测EPCs可能与颅内动脉瘤的形成的病因及修复愈合过程有关,本研究旨在探讨在兔动脉瘤模型诱导过程中EPCs是否参与损伤血管的修复及如何参与。方法利用弹力酶诱导的清洁级兔动脉瘤模型10只,骨髓Ficoll梯度离心法获取单核细胞,经EGM-2MV培养诱导分化获取EPCs,用Hoechst33342和羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(carboxyfluorescein diacetate succinimidylester ,CFSE)对细胞进行双标记。随机分2组,动脉原位回输组(n=5):由动脉瘤原位注射标记的EPCs,一周后观察其在局部粘附、生长等参与动脉瘤修复过程;静脉回输组(n=5):经耳缘静脉回输标记的EPCs,2周后观察EPCs是否通过归巢参与动脉瘤的新生内膜修复,结合HE、免疫组织化学等方法研究分析EPCs参与新生内膜修复的过程。结果所有兔动脉瘤均经病理证实为囊性瘤样结构,培养的EPCs经Hoechst 33342和CFSE双标记,颈动脉原位回输组自体回输EPCs (1.45±0.09)×106个,耳缘静脉回输组,自体回输EPCs(1.47±0.17)×106个。经动脉原位回输组:一周后动脉瘤内血栓及新生内膜内均可见双标记的细胞直接黏附(5/5),而内膜表面未见内皮细胞生长。经静脉回输组:部分动脉瘤壁新生内膜内而非内膜表面可见到归巢的标记细胞(3/5),未见有内皮细胞生长,两组动脉瘤组织的HE染色均未见内膜上皮样细胞分布,免疫组织化学均显示内膜vWF染色阴性。结论EPCs参与了动脉瘤损伤血管的早期内膜修复,但未以转化成内皮细胞形式参与修复。三、内皮祖细胞参与Tubridge支架治疗后内膜重建摘要目的动脉瘤治疗后的血管重建过程一直令人关注,推测EPCs与动脉瘤的血管重建过程有关,本研究目的是探讨EPCs是否参与单纯血流导向支架治疗动脉瘤后新生内膜的重建及如何参与。方法利用血流导向支架治疗弹力酶诱导兔动脉瘤,分支架治疗后2周组和4周组分别观察早期和中期新生内膜修复情况,每组动物5只,将体外扩增的EPCs用Hoechst33342和CFSE双标记,分别于处死前2周经静脉自体回输,共三次回输,每次间隔3天,观察EPCs通过归巢参与动脉瘤的内膜修复情况,结合扫描电镜、病理、免疫组织化学等方法研究分析EPCs参与内膜修复的过程。结果10只兔均成功的诱导成动脉瘤,单纯血流导向支架治疗后,DSA造影随访见动脉瘤完全不显影(10/10),病理下完全闭塞,2周组中双标记示踪细胞在覆盖于支架表面的新生内膜内而非内膜表面和支架周围(3/5),4周组中双标记示踪细胞在覆盖于支架表面的新生内膜内而非内膜表面和支架周围(2/5),扫描电镜及免疫组织化学结果提示,2周时内膜面极少有内皮细胞修复内膜而4周时新生内膜有较多的内皮细胞修复。结论EPCs确实参与了动脉瘤新生内膜愈合过程,但并没有唯一的以分化成内皮细胞方式进行。