胆红素是从动物的胆汁中提取的胆色素,是分析化学及生化研究的重要试剂和贵重的生化药品,具有解热、祛痰、镇静、抗惊、抑菌、降压、促进血红素再生、抑制癌细胞等作用。本研究的目的是确定胆红素高效提取及纯化技术参数,建立胆红素高效提取和纯化工艺路线。试验中以猪胆汁为原料,采取单因素试验、多因素组合试验、响应面数据分析等方法,研究超声波辅助提取胆红素、树脂法提取胆红素、快速法提取胆红素等确定分离纯化的工艺条件并采用紫外光谱、红外光谱、HPLC等鉴定胆红素的方法。1.超声波辅助提取胆红素的研究。研究了超声波功率、超声波频率、超声温度、超声时间、等四个因素对超声波辅助提取胆红素的影响,确定了各单因素的变化范围,在单因素研究的基础上,应用正交组合试验和SAS统计分析法对超声波辅助提取胆红素的工艺条件进行优化,优化后的超声波辅助提取胆红素的最佳工艺参数为:超声波功率为强功率320W,超声波频率为72kHz,超声波处理温度为30℃,超声波处理时间20min。实验证明,经超声波处理后,能有效提高胆汁中胆红素的提取率,胆红素的提取率比传统的方法提高15%,同时可缩短提取时间2h。超声波处理技术已实现工业化应用,因此,超声波辅助提取胆红素的技术能够转化为工厂化生产技术。2.树脂法分离胆红素的研究。将超声波辅助提取法制得胆红素粗提取液采用大孔径阴离子树脂D296R吸附分离,通过单因素实验、正交实验研究了树脂添加量、吸附时间、吸附温度、吸附转速、洗脱液选择、解吸转速、解吸时间等因素对吸附效果的影响,优化了工艺参数。优化后的吸附最佳工艺参数为:树脂添加量为4%、吸附时间为4h、吸附温度为30℃、吸附转速100r/min,树脂吸附率为87.06%;优化后的解吸最佳工艺参数为:二氯甲烷为洗脱液、解吸转速为80r/min、解吸时间为2h,解吸率达到78.15%,胆红素的提取率达到了67.95%。3.快速法提取胆红素的研究。快速法主要是通过酸碱作用使胆红素游离于胆汁中,并采用二氯甲烷萃取提取胆红素,实验采用单因素试验和二次旋转回归组合设计研究了NaOH浓度、水解pH、水解温度、水解时间、萃取pH、乙酸浓度、盐酸浓度等因素对胆红素提取率的影响,研究结果为:NaOH浓度为16%、乙酸浓度15%、盐酸浓度15%、水解pH10.58、萃取pH5.23、水解温度95.75℃、水解时间21.89min,胆红素的平均提取率达到了70.03%。经过对树脂法与快速法的比较分析,确定快速法为提取胆红素的最佳实验方法。4.胆红素的纯化和鉴定。胆红素纯化试验采用有机滤膜、乙醇、甲醇、去离子水等纯化粗品胆红素,胆红素的纯度从68.57%提高到纯化后的97.80%。经紫外光谱扫描显示胆红素样品在453nm时有吸收峰与国家药典颁布一致;胆红素的红外光谱测定结果显示,含有N-H、双键基团、O-H、C-O等峰位,样品谱线、峰形、峰值都与标准品的谱线及数值吻合较好,说明样品的纯度较高。HPLC分析结果显示,纯化后的胆红素样品与胆红素标准品出峰时间一致,纯度达到98.76%。