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背景：
肝细胞癌（Hepatocellularcarcinoma,HCC）是最常见的原发性肝癌，占肝癌的70％-90％[1-3]。HCC是最致命的人类恶性肿瘤之一，并且由于其对抗癌药物的耐药率高，是导致癌症相关死亡率的第三大常见原因[2]。化疗是HCC治疗的重要部分，特别是对于不适用于手术的肝癌晚期患者。因此，寻找新型安全且有效的辅助治疗肝癌的药物是提高患者生存质量的关键之一。鸦胆子苦醇（Brusatol）是一种苦木内酯类化合物，从一种名为鸦胆子（Bruceajavanica）的苦木科植物中分离出来。最近有报道称，鸦胆子苦醇是一种潜在的抗癌药物，对多种细胞系具有强大的细胞毒性作用，包括结直肠[4]，胰腺[5]和肺癌细胞系[6]。然而，在肝细胞癌中，鸦胆子苦醇发挥其抗癌作用的研究甚少，并且其精确分子机制仍然尚未明确。因此，在本研究中我们旨在探讨鸦胆子苦醇在体内和体外对肝癌的影响及其抗肿瘤可能作用机制。
目的：
1.探讨鸦胆子苦醇对肝癌细胞活力、增殖、凋亡、自噬的影响。
2.通过联合自噬抑制剂氯喹（Chloroquine，CQ）阐明其诱导的凋亡与自噬之间的相互关系。
3.研究鸦胆子苦醇在体外对迁移、侵袭以及上皮间质转化的影响。
4.探究裸鼠的人肝脏异种移植肿瘤模型中，鸦胆子苦醇对肿瘤的的侵袭和增殖的影响。
5.研究鸦胆子苦醇对PI3K/Akt/m-TOR信号通路的影响，揭示鸦胆子苦醇介导的人肝癌细胞自噬、凋亡以及抑制增殖的分子机制。
方法：
1.应用细胞培养技术培养人肝癌细胞株Huh7,Hep3B,LM3细胞。
2.细胞活力检测：实验采用CCK-8法检测鸦胆子苦醇对各肿瘤细胞的细胞增殖能力的抑制性影响。
3.通过细胞集落形成实验观察鸦胆子苦醇对肝癌细胞集落形成能力的影响。
4.采用倒置相差显微镜观察鸦胆子苦醇作用不同时间后LM3细胞形态的变化。
5.细胞凋亡检测：采用流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI双染法、Hoechst33342荧光染色检测鸦胆子苦醇对LM3细胞凋亡的影响；采用WesternBlot检测凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase3、Cleaved-PARP、Bax、Bcl-2的表达。
6.细胞自噬检测：采用WesternBlot检测自噬相关蛋白LC3、Beclin-1、P62的表达。
7.鸦胆子苦醇诱导的自噬与凋亡的关系:应用CCK8法检测各组细胞增殖能力，应用Hoechst33342荧光染色检测细胞凋亡。应用WesternBlot(WB)检测自噬相关蛋白LC3-II的表达，检测凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase-3、Cleaved-PARP、Bax、Bcl-2的表达。
8.应用WB检测鸦胆子苦醇对PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白PI3K,Akt,p-Akt,mTOR和p-mTOR蛋白表达情况的影响。
9.采用WB检测上皮间质转化（Epithelial-mesenchymaltransition,EMT）相关蛋白表达变化，划痕实验以及Transwell-migration模型评价鸦胆子苦醇对人肝癌细胞株LM3迁移能力的影响；Transwell-invasion模型评价鸦胆子苦醇对人肝癌细胞株LM3的侵袭能力的影响。
10.构建裸鼠皮下移植瘤成瘤模型。测量肿瘤大小计算肿瘤体积称量裸鼠体重以评价鸦胆子苦醇体内抗肿瘤生长活性。运用血液生化检测和HE染色分别观察对比两组相关肝肾功能指标ALT、AST、Cr、BUN、eGFR的水平以及肝肾病理结构变化。通过免疫组织化学法检测鸦胆子苦醇对LM3移植瘤模型中组织的Ki67，MMP2，MMP9表达水平的影响。
结果：
1.CCK-8结果示，细胞活力随药物浓度的增加而降低。较对照组，处理组形态变化明显。细胞集落形成实验结果示，随着药物作用浓度增加，集落形成能力逐渐降低。
2.流式细胞术结果显示：随着药物浓度和时间增加，诱导的凋亡逐渐增加。Hoechst33342染色法结果示，各组凋亡形态学改变程度及蓝色荧光强度与鸦胆子苦醇作用浓度呈正相关。WB结果显示，较对照组，加药组LM3中Cleaved-Caspase3、Cleaved-PARP、Bax表达被激活，Bcl-2显著降低。
3.WB实验结果示，LC3和P62的蛋白质水平在三种肝癌细胞株细胞中均变化；与Control组比较，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1随药物浓度增加表达上升，P62则相反；与Control组比较，上述指标随着药物处理时间的增加而增加，P62则相反。
4.通过CCK8测细胞活力，CQ组与对照组，无显著差异；鸦胆子苦醇组与对照组较，差异有统计学意义；鸦胆子苦醇＋CQ组与鸦胆子苦醇组较，差异有统计学意义；Hoechst33342染色示，与单独鸦胆子苦醇处理相比，鸦胆子苦醇＋CQ的组中凋亡细胞减少；WB示，与单独鸦胆子苦醇处理的细胞相比，加药组和CQ联合用药组Cleaved-Caspase3，Cleaved-PARP，Bax表达减少，Bcl-2蛋白则增加，且联合用药组中LC3-II升高。
5.WB示PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR表达量较对照组减少。
6.WB示，E-cadherin随药物浓度增加表达增加，N-cadherin，Vimentin相反。划痕实验、迁移及侵袭实验结果示，较对照组，加药组随药物浓度增加愈合能力、迁移、侵袭能力下降。
7.处理组的小鼠肿瘤大小明显小于对照组。血液生化检测和HE染色示两组肝肾功能及病理结构变化无显著差异。免疫组织化学法示，较对照组，处理组Ki67，MMP2，MMP9表达水平均下降。
结论：
鸦胆子苦醇对人肝癌细胞的增殖均有抑制作用并能诱导LM3细胞凋亡和自噬。自噬抑制剂氯喹能够逆转鸦胆子苦醇诱导的细胞凋亡。通过PI3K/Akt/mTOR途径鸦胆子苦醇介导HCC细胞自噬促进凋亡。此外，该药物还能降低HCC细胞侵袭和迁移能力并减少EMT。并具有抑制体内肝细胞肿瘤的生长的作用。这些结果表明鸦胆子苦醇的综合抗癌作用可能对当前化学治疗系统有补充作用。
肝细胞癌（Hepatocellularcarcinoma,HCC）是最常见的原发性肝癌，占肝癌的70％-90％[1-3]。HCC是最致命的人类恶性肿瘤之一，并且由于其对抗癌药物的耐药率高，是导致癌症相关死亡率的第三大常见原因[2]。化疗是HCC治疗的重要部分，特别是对于不适用于手术的肝癌晚期患者。因此，寻找新型安全且有效的辅助治疗肝癌的药物是提高患者生存质量的关键之一。鸦胆子苦醇（Brusatol）是一种苦木内酯类化合物，从一种名为鸦胆子（Bruceajavanica）的苦木科植物中分离出来。最近有报道称，鸦胆子苦醇是一种潜在的抗癌药物，对多种细胞系具有强大的细胞毒性作用，包括结直肠[4]，胰腺[5]和肺癌细胞系[6]。然而，在肝细胞癌中，鸦胆子苦醇发挥其抗癌作用的研究甚少，并且其精确分子机制仍然尚未明确。因此，在本研究中我们旨在探讨鸦胆子苦醇在体内和体外对肝癌的影响及其抗肿瘤可能作用机制。
目的：
1.探讨鸦胆子苦醇对肝癌细胞活力、增殖、凋亡、自噬的影响。
2.通过联合自噬抑制剂氯喹（Chloroquine，CQ）阐明其诱导的凋亡与自噬之间的相互关系。
3.研究鸦胆子苦醇在体外对迁移、侵袭以及上皮间质转化的影响。
4.探究裸鼠的人肝脏异种移植肿瘤模型中，鸦胆子苦醇对肿瘤的的侵袭和增殖的影响。
5.研究鸦胆子苦醇对PI3K/Akt/m-TOR信号通路的影响，揭示鸦胆子苦醇介导的人肝癌细胞自噬、凋亡以及抑制增殖的分子机制。
方法：
1.应用细胞培养技术培养人肝癌细胞株Huh7,Hep3B,LM3细胞。
2.细胞活力检测：实验采用CCK-8法检测鸦胆子苦醇对各肿瘤细胞的细胞增殖能力的抑制性影响。
3.通过细胞集落形成实验观察鸦胆子苦醇对肝癌细胞集落形成能力的影响。
4.采用倒置相差显微镜观察鸦胆子苦醇作用不同时间后LM3细胞形态的变化。
5.细胞凋亡检测：采用流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI双染法、Hoechst33342荧光染色检测鸦胆子苦醇对LM3细胞凋亡的影响；采用WesternBlot检测凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase3、Cleaved-PARP、Bax、Bcl-2的表达。
6.细胞自噬检测：采用WesternBlot检测自噬相关蛋白LC3、Beclin-1、P62的表达。
7.鸦胆子苦醇诱导的自噬与凋亡的关系:应用CCK8法检测各组细胞增殖能力，应用Hoechst33342荧光染色检测细胞凋亡。应用WesternBlot(WB)检测自噬相关蛋白LC3-II的表达，检测凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase-3、Cleaved-PARP、Bax、Bcl-2的表达。
8.应用WB检测鸦胆子苦醇对PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白PI3K,Akt,p-Akt,mTOR和p-mTOR蛋白表达情况的影响。
9.采用WB检测上皮间质转化（Epithelial-mesenchymaltransition,EMT）相关蛋白表达变化，划痕实验以及Transwell-migration模型评价鸦胆子苦醇对人肝癌细胞株LM3迁移能力的影响；Transwell-invasion模型评价鸦胆子苦醇对人肝癌细胞株LM3的侵袭能力的影响。
10.构建裸鼠皮下移植瘤成瘤模型。测量肿瘤大小计算肿瘤体积称量裸鼠体重以评价鸦胆子苦醇体内抗肿瘤生长活性。运用血液生化检测和HE染色分别观察对比两组相关肝肾功能指标ALT、AST、Cr、BUN、eGFR的水平以及肝肾病理结构变化。通过免疫组织化学法检测鸦胆子苦醇对LM3移植瘤模型中组织的Ki67，MMP2，MMP9表达水平的影响。
结果：
1.CCK-8结果示，细胞活力随药物浓度的增加而降低。较对照组，处理组形态变化明显。细胞集落形成实验结果示，随着药物作用浓度增加，集落形成能力逐渐降低。
2.流式细胞术结果显示：随着药物浓度和时间增加，诱导的凋亡逐渐增加。Hoechst33342染色法结果示，各组凋亡形态学改变程度及蓝色荧光强度与鸦胆子苦醇作用浓度呈正相关。WB结果显示，较对照组，加药组LM3中Cleaved-Caspase3、Cleaved-PARP、Bax表达被激活，Bcl-2显著降低。
3.WB实验结果示，LC3和P62的蛋白质水平在三种肝癌细胞株细胞中均变化；与Control组比较，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1随药物浓度增加表达上升，P62则相反；与Control组比较，上述指标随着药物处理时间的增加而增加，P62则相反。
4.通过CCK8测细胞活力，CQ组与对照组，无显著差异；鸦胆子苦醇组与对照组较，差异有统计学意义；鸦胆子苦醇＋CQ组与鸦胆子苦醇组较，差异有统计学意义；Hoechst33342染色示，与单独鸦胆子苦醇处理相比，鸦胆子苦醇＋CQ的组中凋亡细胞减少；WB示，与单独鸦胆子苦醇处理的细胞相比，加药组和CQ联合用药组Cleaved-Caspase3，Cleaved-PARP，Bax表达减少，Bcl-2蛋白则增加，且联合用药组中LC3-II升高。
5.WB示PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR表达量较对照组减少。
6.WB示，E-cadherin随药物浓度增加表达增加，N-cadherin，Vimentin相反。划痕实验、迁移及侵袭实验结果示，较对照组，加药组随药物浓度增加愈合能力、迁移、侵袭能力下降。
7.处理组的小鼠肿瘤大小明显小于对照组。血液生化检测和HE染色示两组肝肾功能及病理结构变化无显著差异。免疫组织化学法示，较对照组，处理组Ki67，MMP2，MMP9表达水平均下降。
结论：
鸦胆子苦醇对人肝癌细胞的增殖均有抑制作用并能诱导LM3细胞凋亡和自噬。自噬抑制剂氯喹能够逆转鸦胆子苦醇诱导的细胞凋亡。通过PI3K/Akt/mTOR途径鸦胆子苦醇介导HCC细胞自噬促进凋亡。此外，该药物还能降低HCC细胞侵袭和迁移能力并减少EMT。并具有抑制体内肝细胞肿瘤的生长的作用。这些结果表明鸦胆子苦醇的综合抗癌作用可能对当前化学治疗系统有补充作用。