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枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)B44、B4菌株是从小麦根际土壤中分离得到的。经测定,两种枯草芽孢杆菌对棉花枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌和小麦全蚀病菌4种植物病原真菌有较强的抑制作用[1]。为了进一步研究两种生防菌株的有效成份,本文通过研究确定了枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B44、B4两种菌株的最佳发酵培养条件和确认了发酵粗提液对24种植物病原真菌的抑制作用;并从B44菌株发酵液中分离得到了抗菌蛋白,研究了其性质,对今后纯化该物质和应用研究打下了良好的基础。
采用不同的培养基、不同PH值、不同的温度、不同的通氧量、不同的发酵时间对B44、B4两种菌株进行发酵培养,检测其发酵液的抑菌活性,得到了两种菌株产生抗菌蛋白的最佳条件:(1)B44菌株:在pH值为7的Wakimoto's培养基中,以30℃的温度、装液量为90ml,摇床转速为200r/min震荡培养24h可得到大量的抗菌蛋白;(2)B4菌株:在pH值为8的Wakimoto's培养基中,以30℃的温度、装液量为70ml,摇床转速为200r/min震荡培养48h可得到大量的抗菌蛋白。
采用上述的培养条件,用环柱测定法测定了B44和B4菌株产生的抗菌蛋白粗提液对小麦全蚀病菌和苹果轮纹病菌等24种植物病原真菌的抑制作用,检测结果显示,枯草芽孢杆菌B44菌株产生的抗菌蛋白的抑菌效果要比B4菌株产生的好,故在以后的试验过程中主要以B44产生的抗菌蛋白为主要研究对象。将B44菌株进行盆栽抑菌试验,抑菌结果较好,抑菌效果达50%以上。
枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B44菌株发酵培养产生的代谢产物,经80%饱和硫酸铵沉淀,茚三酮检测,显色为淡紫色,初步确认所产生的抗菌蛋白含有多肽或蛋白质或氨基酸。产生的沉淀经过石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3种有机溶剂进行液液分配萃取后,发现抑菌物质主要存留在水层,对水层物质进行透析、脱盐。将粗提物进行ODS-C18反相硅胶柱层析,分别用30%、50%、80%的甲醇水溶液做梯度洗脱。活性成分富集在80%的甲醇洗脱液中,浓缩后通过SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳可以明显地看出含有抗菌活性的蛋白条带,分子量约为10.53-20.10KDa,将所得抗性物质进行抑菌试验,抑菌效果较好。对所得抗菌蛋白进行酸碱稳定性检测、溶解度、pH值及氯仿的敏感性测定。