一、研究背景非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)包括肝细胞单纯性脂肪变、非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis,NASH)及由其进展的肝纤维化和肝硬化[1]。由于肥胖和代谢综合症发病率快速增加,NAFLD成为全世界范围内最主要的慢性肝病之一。与单纯性脂肪变相比,NASH患者进展为终末期肝病的风险显著增加。目前,NASH发生及发展为肝纤维化的分子机制尚未阐明,尚无特异性治疗NASH及NASH相关肝纤维化的药物。临床及动物研究结果已证实,肝组织中性粒细胞浸润增强是NASH的重要组织病理学特征之一[1]。中性粒细胞颗粒蛋白是中性粒细胞发挥免疫调控作用的重要因子。Micro RNA-223(miR-223)是一种在中性粒细胞中具有高丰度的micro RNA,其在多种炎症状态下调节中性粒细胞的活化及炎性反应。研究miR-223及中性粒细胞颗粒蛋白调控NASH相关肝纤维化的功能和分子机制对于深入揭示NASH进展为肝纤维化的关键病理生理机制以及发现药物研发的新型、潜在靶点具有重要科学意义。二、研究目的本课题的总体研究目标在于揭示miR-223/中性粒细胞颗粒蛋白信号轴调控NASH相关肝纤维化的功能和分子机制,具体包括:1.采用低蛋氨酸和胆碱缺乏及L-氨基酸限定的高脂饮食(CDAHFD),诱导可模拟NASH相关肝纤维化的关键临床和组织病理学特征的小鼠模型;2.研究miR-223调控NASH肝脏炎症及相关肝纤维化及中性粒细胞炎症反应的病理生理学功能;3.通过转录组测序鉴定出miR-223调控中性粒细胞颗粒蛋白的关键转录因子;4.利用miR-223敲除和野生型小鼠骨髓移植形成miR-223嵌合体小鼠,验证髓系细胞及其分化的中性粒细胞是否是介导miR-223调控NASH及其相关肝纤维化的关键细胞。三、研究策略与方法1.NASH相关肝纤维化小鼠模型的诱导及表型鉴定C57 BL/6J野生型的10周龄雄性小鼠以CDAHFD饮食饲喂10周诱导NASH相关肝纤维化。通过肝组织的H&E染色、Masson染色、天狼星红染色、α-SMA免疫组织化学染色、肝纤维化相关基因m RNA水平检测以及血清ALT和AST生化检测进行NASH组织病理学特征、肝纤维化及肝损伤程度分析。通过体重、瞬时血糖以及代谢耗氧量和体脂率的检测鉴定小鼠肥胖代谢表型。2.Mi R-223表达水平检测以实时定量PCR方法,检测miR-223在标准饲料和CDAHFD饮食饲喂10周的野生型(wild type,WT)雄性小鼠肝脏中的表达水平。3.Mi R-223敲除和野生型对照小鼠NASH相关肝纤维化的评价C57 BL/6J背景的miR-223敲除(miR-223 knockout,miR-223 KO)小鼠和野生型对照小鼠按照与第1部分相同的方法诱导NASH相关肝纤维化。造模结束后,运用上述实验方法检测NASH组织病理学、肝纤维化、肝损伤及代谢表型。通过免疫组织化学方法检测中性粒细胞肝脏浸润及在LPS诱导炎症中的迁移能力、肝脏中性粒细胞颗粒蛋白的表达。同时运用蛋白印迹方法检测肝组织中中性粒细胞颗粒蛋白的表达。检测中药干预后的LPS激活的巨噬细胞中TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-6、MPO、LCN2、PR3、NE的m RNA水平。4.转录组学筛选miR-223下游转录因子进行miR-223的转录组测序,筛选出miR-223调控中性粒细胞颗粒蛋白的潜在转录因子。通过检测野生型和miR-223 KO小鼠中性粒细胞和肝脏非实质细胞中m RNA水平验证并进一步筛选转录因子。双荧光素酶报告基因检测miR-223是否直接与转录因子结合发挥其作用。利用RT-PCR的方法检测野生型和miR-223 KO小鼠骨髓细胞和中性粒细胞中多个中性粒细胞颗粒蛋白(MPO、LCN2、PR3、NE)的m RNA水平。5.骨髓移植形成miR-223髓系细胞嵌合体小鼠通过骨髓移植选择性改变小鼠骨髓中miR-223的表达,并诱导NASH相关肝纤维化。造模结束后,运用上述检测方法检测NASH组织病理学、肝纤维化程度及代谢表型。四、研究结果1.CDAHFD饮食诱导小鼠模型可模拟临床NASH相关肝纤维化的关键组织病理学和代谢异常模型小鼠表现出NASH典型的组织病理学特征,包括脂肪变性、气球样变以及肝组织炎症;并表现出明显的纤维化;该模型除体重及血糖外,其它代谢表型与NASH患者相符,包括体脂率升高和代谢耗氧量降低(n=5/组)。2.Mi R-223在小鼠NASH相关肝纤维模型的肝组织表达丰度显著升高Mi R-223在标准饲料和CDAHFD饮食诱导小鼠肝脏中的表达水平检测结果显示,miR-223在CDAHFD饮食诱导的NASH相关肝纤维化模型小鼠肝脏中的表达显著升高(n=5/组)。3.Mi R-223在NASH相关肝纤维化中的病理生理学功能1)Mi R-223缺失显著加重CDAHFD饮食诱导的实验性NASH在CDAHFD饮食诱导的情况下,miR-223 KO小鼠肝脏NASH组织病理学特征,包括脂肪变性、气球样变以及肝小叶炎症较野生型对照组显著加重(n=5/组)。2)Mi R-223缺失显著加重CDAHFD饮食诱导的肝纤维化在CDAHFD饮食诱导的情况下,miR-223 KO小鼠较野生型小鼠肝脏出现更加明显的胶原沉积及肝纤维化相关基因m RNA水平升高(n=4-5/组)。3)Mi R-223缺失显著加重CDAHFD饮食诱导的肝细胞损伤在CDAHFD饮食诱导的情况下,miR-223 KO小鼠的血清肝细胞损伤指标ALT、AST水平较野生型小鼠显著升高(n=4-7/组)。4)Mi R-223缺失不影响CDAHFD饮食诱导的肥胖代谢表型在CDAHFD饮食诱导的情况下,miR-223 KO小鼠体重、血糖水平、体脂率和代谢耗氧量与野生型小鼠相比无显著性差异(n=4-12/组)。4.Mi R-223缺失显著增强中性粒细胞肝脏浸润及炎症反应1)Mi R-223缺失明显增加CDAHFD饮食诱导小鼠肝脏中性粒细胞浸润在CDAHFD饮食诱导的情况下,miR-223 KO小鼠较野生型小鼠肝脏中中性粒细胞明显增多(n=5/组)。2)Mi R-223缺失明显增强中性粒细胞迁移能力在LPS诱导炎症的情况下,miR-223 KO小鼠较野生型小鼠炎症部位中性粒细胞明显增多(n=5/组)。3)Mi R-223缺失明显增加CDAHFD饮食诱导小鼠肝脏中性粒细胞颗粒蛋白表达在CDAHFD饮食诱导的情况下,miR-223 KO小鼠较野生型小鼠肝脏中MPO、LCN2、PR3蛋白水平升高(n=5/组)。4)化浊中药抑制免疫细胞中促炎因子及颗粒蛋白表达5.介导Mi R-223调控中性粒细胞颗粒蛋白关键转录因子的筛选1)Mi R-223调控中性粒细胞颗粒蛋白表达的关键转录因子测序筛选结果通过miR-223敲除和野生型对照小鼠原代中性粒细胞的转录组测序,我们筛选、鉴定出miR-223缺失时显著上调、作为miR-223靶基因并且与四种颗粒蛋白MPO、LCN2、PR3、NE相关的转录因子:Fosl2、Plagl1。2)Mi R-223调控中性粒细胞颗粒蛋白表达的关键转录因子测序筛选结果验证与WT小鼠相比,miR-223 KO小鼠肝脏非实质细胞及原代中性粒细胞中Fosl2、Plagl1的m RNA水平均升高,说明Fosl2、Plagl1是miR-223调控中性粒细胞颗粒蛋白的关键转录因子。3)双荧光素酶报告基因方法检测miR-223与转录因子的相互作用当与含有Fosl2基因3’-UTR序列的重组质粒共转染时,miR-223的过表达导致萤火虫荧光素酶的表达降低,提示miR-223直接作用于Fosl2 m RNA的3’-UTR序列,显著抑制Fosl2的表达。综合上述结果,miR-223通过抑制转录因子Fosl2的表达而抑制中性粒细胞颗粒蛋白表达。6.髓系细胞来源的miR-223在NASH相关肝纤维化中的病理生理学功能1)野生型小鼠骨髓细胞嵌合改变miR-223 KO小鼠经CDAHFD饮食诱导的NASH肝脏炎症及其相关肝纤维化2)野生型小鼠骨髓细胞嵌合不影响miR-223敲除小鼠CDAHFD饮食诱导的肥胖代谢表型五、结论1.本课题采用CDAHFD饮食饲喂10周诱导小鼠NASH相关肝纤维化,该模型小鼠表现出典型的NASH组织病理学特征、肝纤维化及多个肥胖相关代谢表型,可作为研究NASH及其相关肝纤维化病理生理机制和新药干预效果的小鼠模型。2.Mi R-223缺失显著加重模型小鼠的肝脏炎症、肝损伤及肝纤维化。3.Mi R-223缺失显著增强中性粒细胞肝脏浸润及迁移能力,上调NASH状态下肝组织中中性粒细胞颗粒蛋白表达水平。4.Mi R-223通过抑制转录因子Fosl2的表达而抑制中性粒细胞颗粒蛋白表达。5.髓系细胞及其分化的中性粒细胞是介导miR-223调控NASH及其相关肝纤维化的关键细胞。综合上述研究结果,本课题揭示了miR-223通过直接抑制转录因子Fosl2的表达抑制中性粒细胞颗粒蛋白表达,显著减轻NASH肝脏炎症、肝损伤及相关肝纤维化。因此,miR-223、Fosl2和中性粒细胞颗粒蛋白可作为NASH及相关肝纤维化新药研发的潜在靶点。