研究背景随着发病率和死亡率的升高,恶性肿瘤已经成为国人死亡的最主要原因。其中肺癌发病率高达17%,是目前发病率位居第一的恶性肿瘤,而非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)作为最主要的肺癌已成为癌症死亡之首。NSCLC是当前国家乃至世界最大的公共卫生问题,除了传统的手术切除之外,放射治疗是治疗肺癌最有效的方法,被推荐作为NSCLC的主要治疗手段。但是,放疗并发症和肿瘤放疗抵抗两大难题严重阻碍了放疗实施和放疗效果,严重影响了肿瘤患者的预后生存状况。放射性肺纤维化(Radiation-induced pulmonary fibrosis,RIPF)作为肺癌放疗后期常见严重并发症限制了放疗剂量及次数,目前临床上还没有有效的防治措施。同样,放疗过程中肺癌可能产生的放射抵抗更是削弱了其对肿瘤的杀伤效果,而通过增加放疗剂量和次数来提高放疗效果势必会增加放疗并发症发生的风险,所以只能通过增加肺癌的放疗敏感性来提升放疗效果,然而目前临床上尚无有效的方法来提高肺癌放疗的敏感性。因此,解决两大难题,寻求放疗并发症RIPF的有效防治措施和提高放疗敏感性对于肺癌放疗意义重大。对于RIPF的发病机制,目前尚不明确。大量文献报道,组织器官的纤维化与上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)有着紧密的联系,EMT在肺纤维化的发生发展中发挥重要作用。肺泡上皮细胞通过EMT转变为激活的成纤维细胞并在肺间隙产生胶原蛋白等细胞外基质蛋白,从而导致肺纤维化的形成。近期有报道称电离辐射能够引起正常肺泡上皮细胞发生EMT,与辐射引起肺组织发生的RIPF有密切关联。靶向辐射引起的EMT有可能成为防治肺癌放疗并发症RIPF的重要突破口。本课题组前期研究发现TBK1通过调控EMT经典转录因子ZEB1促进辐射诱导肺癌细胞发生EMT,TBK1在辐射引起的肺癌EMT的发生发展中可能发挥重要的作用。但是,目前TBK1在辐射引起正常肺组织发生EMT和RIPF中的作用研究尚未见报道,本课题第一部分将首次探讨TBK1通过靶向正常肺泡上皮细胞的EMT对RIPF的发生发展的作用及机制,旨在为肺癌放疗常见严重并发症的防治提供有效的防治靶点。对于提高肺癌特别是NSCLC的放疗效果,除了有效防治其并发症外,增加肺癌的放疗敏感性同等重要,因此第二部分我们将着重研究肺癌的放射敏感性,首次探讨TBK1对肺癌放射敏感性的作用,更全面的研究TBK1在肺癌放疗中发挥的作用。此外,我们通过文献调研和预实验发现在肺癌EMT中发挥重要作用的分子MSI2可能在肺癌放疗中也起重要作用,我们也将在第二部分首次探讨MSI2对NSCLC放射敏感性的作用及机制,为肺癌放疗增敏提供有效的新靶点。研究目的本课题从解决严重影响肺癌放疗效果的两大难题—肺癌放疗并发症和肺癌放疗抵抗入手,通过体内、体外实验以及临床样本检测研究TBK1在辐射引起正常肺泡上皮细胞发生的EMT中发挥的作用及机制,探讨TBK1是否通过靶向EMT在RIPF的发生发展中起重要作用,为肺癌放疗常见严重并发症RIPF的有效防治提供新靶点,探究TBK1、MSI2对肺癌放射敏感性的作用及机制,为肺癌的放疗增敏提供有效的新策略,进而综合、有效的改善临床肺癌放疗的效果。研究方法1、细胞实验通过Western blot、免疫荧光以及形态观察的方法检测RLE-6TN、MLE 12细胞照射后发生的EMT及其程度。采用细胞克隆形成、增殖、凋亡、周期的检测方法研究A549、H460、H1299等细胞的放射敏感性。应用彗星电泳、免疫共聚焦的方法检测DNA损伤程度。分别构建TBK1、MSI2、RBM17的干扰质粒或过表达质粒,并通过转染或慢病毒感染的方法敲低或过表达细胞相应的分子来研究其作用及机制。分别采用AKT、ERK、TBK1、ATR的特异性抑制剂PF-04691502、SCH772984、Amlexanox、VE-821探讨分子间相互调控关系。通过免疫沉淀的方法探讨蛋白之间的相互作用关系。2、动物实验所有小鼠均随机分组并通过灌胃的方式给药。对C57BL/6小鼠肺部进行20Gy照射并饲养至照后3到12个月来构建小鼠放射性肺纤维化模型。C57BL/6小鼠全身照射7.5或8.5Gy后密切观察1个月进行小鼠照后生存分析。裸鼠荷瘤后1个月15Gy局部照射,15天后进行肿瘤测量分析。通过Western blot、免疫荧光的方法检测小鼠肺组织发生的EMT及其程度。采用HE染色、MASSON染色、羟脯氨酸检测的方法分析小鼠放射性肺纤维化的发展程度。3、临床样本检测从上海市肺科医院采集80例肺癌组织样本及相应的癌旁正常肺组织样本,制作成组织芯片,并对组织芯片进行病理分析和免疫组化检测,使用扫描仪进行扫描并观察,最后通过免疫组化评分进行量化分析。4、统计学分析本课题所有统计均使用GraghPad Prism软件进行分析并绘图。所有统计数据至少重复3次,用平均数±标准误来表示。两组间样本比较时用非配对双尾t检验,两组以上比较时用单因素方差分析然后用Dunnett多重比较检验,生存率采用KaplanMeier分析并通过对数秩检验确定生存曲线之间的显著性,p<0.05时认为差异有统计学意义。研究结果1、TBK1在辐射引起的EMT和RIPF中的作用通过体外实验发现辐射能够引起肺泡上皮细胞发生EMT,表现为上皮标志分子表达下调,间质标志分子表达上调,细胞形态从立方体、铺路石样转变为伸出伪足、拉长和肿胀变大,特别是8Gy照射后48小时发生这种变化的细胞达70%;辐射能引起肺泡上皮细胞TBK1的表达升高,而敲低TBK1可以逆转辐射引起的EMT;TBK1抑制剂Amlexanox对肺泡上皮细胞具有辐射防护作用;体内实验显示Amlexanox逆转了小鼠肺组织发生的EMT,显著减轻了小鼠的RIPF,并且提高了小鼠全身照射后的生存率。2、TBK1在辐射引起的EMT中的作用机制体外实验证实AKT和ERK均在照射后被激活,分别抑制AKT和ERK的激活都能够逆转辐射引起的EMT;敲低TBK1能够分别抑制照射后AKT和ERK的激活,但是抑制AKT或ERK的激活均不影响照射后TBK1的升高,此外抑制AKT能够减弱ERK照射后的激活,而抑制ERK却对AKT照射后的激活无影响,TBK1在AKT和ERK的上游发挥作用,AKT在ERK的上游发挥作用。TBK1可能是通过激活AKTERK通路促进辐射引起EMT。3、TBK1对NSCLC放射敏感性的影响通过敲低TBK1以及使用TBK1的抑制剂证实抑制TBK1能够降低个别NSCLC细胞的增殖水平,但是对大部分NSCLC细胞照射后的克隆形成能力、增殖水平以及凋亡水平没有明显的影响,抑制TBK1即不增加NSCLC的放射敏感性,也不增加其辐射抵抗。4、MSI2在NSCLC的发生发展中的作用体外实验表明敲低MSI2后肺癌细胞的克隆形成能力和增殖水平都降低,而RESCUE MSI2后克隆形成能力和增殖水平都升高;体内荷瘤实验显示敲低MSI2的肿瘤体积明显减小,MSI2促进肺癌的生长。5、MSI2对NSCLC放射敏感性的影响通过体外实验证实敲低MSI2后降低了细胞照射后的克隆形成能力、增殖水平,提高了凋亡水平,而RESCUE MSI2后又能逆转这些效应;体内荷瘤实验证实敲低MSI2能够明显减小照射后肿瘤的大小,敲低MSI2增加了肺癌细胞的放射敏感性,MSI2能够促进肺癌细胞的放射抵抗作用。6、MSI2对NSCLC放射敏感性的作用机制我们通过免疫沉淀-质谱联用的方法筛选了照射后与MSI2相互作用的RBM17分子,在体内外实验中证实敲低RBM17也具有放射增敏作用,并且MSI2和RBM17相互协同促进NSCLC的放射增敏;通过体外实验发现MSI2和RBM17在照射后0.5h就开始入核,8h入核最明显,而到24h都明显出核,免疫沉淀证实MSI2、RBM17、ATR三者在照射后均相互作用,抑制RBM17影响MSI2的入核和ATR的相互作用,而抑制MSI2却不影响RBM17的入核以及和ATR的相互作用,使用ATR抑制剂不影响MSI2和RBM17的入核,MSI2可能是通过RBM17的募集作用入核并与ATR相互作用激活下游CHK1从而发生DNA损伤修复作用,最后引起肺癌的放射抵抗作用。研究结论1、抑制TBK1可以逆转EMT的发生从而减轻放射性肺纤维化的程度2、TBK1可能通过激活AKT-ERK通路促进辐射引起肺泡上皮细胞发生EMT3、抑制TBK1对NSCLC的放射敏感性无影响4、MSI2促进NSCLC的发生发展5、抑制MSI2对NSCLC具有显著的辐射增敏作用6、MSI2通过RBM17募集入核与ATR相互作用并激活ATR及下游DNA损伤反应通路发挥放射抵抗作用