虫媒病毒(Arbovirus)是指一类通过吸血昆虫叮咬敏感的脊椎动物而在人、畜间传播的病毒。其特点是病毒可在昆虫体内繁殖，但昆虫本身不发病，通过叮咬将病毒传播给人、畜，引起人畜患病。虫媒病毒分布在黄病毒科、披膜病毒科、布尼亚病毒科等14个科，全世界目前已发现530余种，其中在我国已分离到的有9种，实际我国存在的虫媒病毒可能远不止以上这些。另外，随着国际交往的日益频繁，境外虫媒病毒病传入我国的可能性也显著增加，因此，快速准确地检测虫媒病毒的感染在传染病防控上具有重要的现实意义。基因芯片技术是20世纪90年代发展起来的一种快速高通量的新技术，具有高通量、高度平行性及高度自动化等特点。本研究以甲病毒属的东方马脑炎病毒(Eastern equine encephalitis virus，EEEV)、西方马脑炎病毒(Western equine encephalitis virus，WEEV)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus，VEEV)、辛德毕斯病毒(sindbis virus)和马雅罗病毒(Mayaro virus)，黄病毒属的登革热病毒(Dengue fever virus)、西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)、日本乙型脑炎病毒(Japanese B encephalitis virus，JBEV)和森林脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus，TBEV)，汉坦病毒属的汉坦病毒(Hantaan virus)及布尼亚病毒属的布尼安亚病毒(Bunyamwera virus)等13种主要虫媒病毒为研究对象，利用基因芯片技术，设计针对以上病毒的种及属水平的寡核苷酸探针，建立能对这些病毒进行属水平筛查及种水平鉴定的基因芯片技术，通过属和种水平的检测结果相互验证，为虫媒病毒的检测与鉴定提供一种高通量的新方法。首先，从Genebank获得以上虫媒病毒的全部基因组序列，利用ClustalX和BLAST等比对软件，设计针对13种虫媒病毒所在的3个属的通用寡核苷酸探针，用于病毒的属水平筛查。然后设计针对每种病毒的特异性寡核苷酸探针，用于每种病毒的检测鉴定。寡核苷酸探针长度均为70-mer，Tm值为80±5℃。将设计好的探针与Genebank上所有病毒基因组序列进行比对，验证其种属特异性，然后进行探针合成和基因芯片制备。所有病毒在BSL-3和BSL-2实验室进行培养，待检病毒核酸通过锚定随机PCR进行扩增，经荧光染料标记后与基因芯片杂交，利用激光共聚焦扫描仪扫描后进行结果分析。在对基因芯片杂交条件、洗涤条件等进行优化的基础上，对以上13种病毒分别进行单个病毒标本及两种以上病毒的模拟混合感染标本进行检测，同时对该检测方法的特异性、敏感性及可重复性等进行验证。针对甲病毒属、黄病毒属和布尼亚病毒属各设计了3～10条属水平探针。在此基础上，针对每种病毒各设计5条寡核苷酸检测探针以及相同数量的互补序列探针，以覆盖该病毒所有的分离株。探针长度均为70mer，Tm值介于75～85℃，探针总数为153条。利用优化后的杂交条件，对13种虫媒病毒的分别检测均获得了种及属特异性杂交信号，非特异杂交不明显。将乙型脑炎病毒和马雅罗病毒混合后，模拟混合病毒感染，也得到了乙型脑炎病毒和马雅罗病毒种和属的特异杂交信号。以丙型肝炎病毒、狂犬病毒和风疹病毒作为对照以同样方法与芯片进行杂交，均未得到阳性检测结果，表明该芯片具有良好的特异性。以马雅罗病毒核酸为待检标本，进行基因芯片敏感度的测定，结果显示，病毒核酸量≥0.003pmol时，可得到良好的杂交信号(1g信号强度≥2.5)。为了进一步验证基因芯片检测方法的特异性，对所检测的每一种病毒同时进行了PCR检测。两种检测所采用的核酸为同一批次提取的病毒RNA，以确保验证结果的可靠性。结果显示，两种检测结果一致，进一步表明我们所建立的基因芯片检测方法具有较好的特异性。联合应用本研究芯片和本室以前建立的人类致病病毒属水平筛查基因芯片对一株新分离病毒进行了筛查和检测，检测结果显示该病毒为乙型脑炎病毒，与PCR及测序结果一致。本研究初步建立了13种虫媒病毒的基因芯片检测技术，可用于对以上虫媒病毒进行属水平筛查及种水平检测鉴定，并且可以进行混合感染标本的检测，为虫媒病毒的检测与鉴定提供了一种高通量的新手段。