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第一部分京尼平交联II型胶原支架促进脂肪来源干细胞向髓核样细胞分化
目的：
椎间盘位于脊柱的椎骨之间。它们有将施加在相邻椎体上的压力分散和保持脊柱灵活性的作用。髓核位于椎间盘的中心，并被纤维环和软骨终板包围。髓核的退化将导致椎间盘力学性能的改变并引起椎间盘退变和慢性下腰痛。基于脂肪来源干细胞(ADSCs)的组织工程是一种对于椎间盘退变有前景的治疗方法。II型胶原蛋白是髓核(NP)中的天然成分，并具有促进ADSC分化为NP样细胞的能力。本研究旨在建立一个经过京尼平交联的三维(3D)II型胶原蛋白支架，以及确定支架对ADSCs分化为NP样表型的生物学效应。
方法：
本研究使用不同浓度的京尼平来交联3DII型胶原蛋白支架。微观结构，表面形貌，力学强度，孔隙率，溶胀性和检测支架的生物稳定性以评估支架性质。通过检测细胞增殖、基因和蛋白质的表达来评估ADSCs上的支架及其相关的分子机制。
结果：
使用0.1％京尼平交联没有明显改变支架的形态，与0.5％京尼平交联后，支架变得不规则，骨架扭曲并折叠，随着京尼平浓度的增加，支架的多孔结构逐渐消失。未交联的3DII型胶原支架的杨氏模量为1.196±0.262MPa。用0.1％京尼平进行交联时杨氏模量增加到2.326±1.123MPa。当京尼平的浓度增加到0.5％和1％，杨氏模量迅速增加到12.517±2.652和19.531±4.264MPa。3DII型胶原蛋白支架的孔隙率为95.673±0.463％。0.1％的京尼平不会显着降低孔隙率(95.206±0.663％，p＞0.05)。随京尼平浓度增加到0.5％和1％，支架的孔隙率减少到92.503±1.352％和89.533±0.794％。而戊二醛交联的支架孔隙率为(86.791±1.163％)。各组中总羟脯氨酸含量都随时间增加。在所有时间点羟脯氨酸的释放随京尼平浓度的增加而降低，0.1％京尼平交联支架与其他组相比显示出最高的细胞增殖，而0.5％京尼平与非交联组相比也显着提高了细胞增殖(p＜0.01)。0.1％京尼平交联组的Acan，Sox9和Col2基因表达水平与其他组相比最高。与0％，0.1％和0.5％京尼平交联的3DII型胶原蛋白支架明显提升了Krt19(与对照组相比分别增加了4.86、11.44和5.99倍)和Pax1(与对照组相比，分别为12.43、18.00和6.43倍)的表达。3DII型胶原蛋白支架与0.1％京尼平交联下培养ADSC后，Foxa2，Shh和Gli1三个基因标记的表达均显着增加。
结论：
京尼平交联增强了II型胶原蛋白支架的稳定性，但是却改变了II型胶原支架的内在特性。与0.1％交联的支架京尼平在维持支架构型的基础上提高了生物稳定性。0.1％的京尼平交联支架可促进ADSC的增殖和向NP样细胞分化，以及SonicHedgehog(Shh)的基因和蛋白质表达增加。这些结果表明，0.1％的京尼平是建立具有生物稳定性的3DII型胶原蛋白支架并诱导ADSC增殖和通过Shh信号通路的激活向NP样表型分化的的最佳浓度。
第二部分京尼平交联细胞传递系统用于脂肪来源干细胞的分化和髓核再生
目的：
基于干细胞的组织工程学是椎间盘退行性病变的可能疗法。组织工程学需要一个能保持置入细胞的功能且具有良好机械性能的生物支架。去细胞髓核(dNP)有作为合适生物支架的可能性，因为它模拟了自然髓核的成分。然而，去细胞过程中基质丢失和移植困难限制了dNP支架的临床应用。
方法：
本研究制作了一个基于可注射dNP的细胞传递系统(NPCS)并通过评估微观结构、生化成分、含水量、生物安全性、生物稳定性和机械性能来评估其性能。本研究也探索了生物支架对于ADSCs在体外向np样分化的促进作用，及NPCS在体内动物模型中对退变髓核的再生作用。
结果：
约68%胶原和43%sgag和在30天后留在NPCS中。培养在0.02%京尼平交联NPCS中的ADSCs在第14天细胞增殖明显高于其他组。与不同浓度的京尼平交联的NPCS表现出与新鲜NP相似的含水量。当频率为0.1或1rad/s时，三组G和G的值无显著性差异。而当频率为10rad/s时，dnp的G和G值显著低于其他组。此外，10rad/s时0.02%京尼平交联npcs和新鲜np的G(分别为13.71±0.53和14.19±0.59kpa)和G(分别为6.41±0.15和6.56±0.12千帕)相似。0.02％的京尼平交联的NPCS组的Acan基因表达水平第7天高于其他两组。dNP与0.02％京尼平交联的NPCS之间第7天时Col2和Sox9的基因表达水平无显着差异。第14天时，Acan，Col2，Sox9在0.02％京尼平交联的NPCS组中基因表达水平显着高于其他组。在第16周NPCS处理的髓核的椎间盘高度指标(81%)和MRI指标(349.05±38.48)明显高于退变的髓核。在体内研究中NPCS也恢复了一部分ECM成分和退变髓核的结构。
结论：
NPCS与0.02%京尼平交联后有良好的生物和机械特性，体外研究显示NPCS具有良好的生物相容性，能够诱导ADSCs的髓核样分化和细胞外基质(ECM)合成。体内植入研究证明NPCS在所使用的动物模型中可以部分再生退变的髓核。
目的：
椎间盘位于脊柱的椎骨之间。它们有将施加在相邻椎体上的压力分散和保持脊柱灵活性的作用。髓核位于椎间盘的中心，并被纤维环和软骨终板包围。髓核的退化将导致椎间盘力学性能的改变并引起椎间盘退变和慢性下腰痛。基于脂肪来源干细胞(ADSCs)的组织工程是一种对于椎间盘退变有前景的治疗方法。II型胶原蛋白是髓核(NP)中的天然成分，并具有促进ADSC分化为NP样细胞的能力。本研究旨在建立一个经过京尼平交联的三维(3D)II型胶原蛋白支架，以及确定支架对ADSCs分化为NP样表型的生物学效应。
方法：
本研究使用不同浓度的京尼平来交联3DII型胶原蛋白支架。微观结构，表面形貌，力学强度，孔隙率，溶胀性和检测支架的生物稳定性以评估支架性质。通过检测细胞增殖、基因和蛋白质的表达来评估ADSCs上的支架及其相关的分子机制。
结果：
使用0.1％京尼平交联没有明显改变支架的形态，与0.5％京尼平交联后，支架变得不规则，骨架扭曲并折叠，随着京尼平浓度的增加，支架的多孔结构逐渐消失。未交联的3DII型胶原支架的杨氏模量为1.196±0.262MPa。用0.1％京尼平进行交联时杨氏模量增加到2.326±1.123MPa。当京尼平的浓度增加到0.5％和1％，杨氏模量迅速增加到12.517±2.652和19.531±4.264MPa。3DII型胶原蛋白支架的孔隙率为95.673±0.463％。0.1％的京尼平不会显着降低孔隙率(95.206±0.663％，p＞0.05)。随京尼平浓度增加到0.5％和1％，支架的孔隙率减少到92.503±1.352％和89.533±0.794％。而戊二醛交联的支架孔隙率为(86.791±1.163％)。各组中总羟脯氨酸含量都随时间增加。在所有时间点羟脯氨酸的释放随京尼平浓度的增加而降低，0.1％京尼平交联支架与其他组相比显示出最高的细胞增殖，而0.5％京尼平与非交联组相比也显着提高了细胞增殖(p＜0.01)。0.1％京尼平交联组的Acan，Sox9和Col2基因表达水平与其他组相比最高。与0％，0.1％和0.5％京尼平交联的3DII型胶原蛋白支架明显提升了Krt19(与对照组相比分别增加了4.86、11.44和5.99倍)和Pax1(与对照组相比，分别为12.43、18.00和6.43倍)的表达。3DII型胶原蛋白支架与0.1％京尼平交联下培养ADSC后，Foxa2，Shh和Gli1三个基因标记的表达均显着增加。
结论：
京尼平交联增强了II型胶原蛋白支架的稳定性，但是却改变了II型胶原支架的内在特性。与0.1％交联的支架京尼平在维持支架构型的基础上提高了生物稳定性。0.1％的京尼平交联支架可促进ADSC的增殖和向NP样细胞分化，以及SonicHedgehog(Shh)的基因和蛋白质表达增加。这些结果表明，0.1％的京尼平是建立具有生物稳定性的3DII型胶原蛋白支架并诱导ADSC增殖和通过Shh信号通路的激活向NP样表型分化的的最佳浓度。
第二部分京尼平交联细胞传递系统用于脂肪来源干细胞的分化和髓核再生
目的：
基于干细胞的组织工程学是椎间盘退行性病变的可能疗法。组织工程学需要一个能保持置入细胞的功能且具有良好机械性能的生物支架。去细胞髓核(dNP)有作为合适生物支架的可能性，因为它模拟了自然髓核的成分。然而，去细胞过程中基质丢失和移植困难限制了dNP支架的临床应用。
方法：
本研究制作了一个基于可注射dNP的细胞传递系统(NPCS)并通过评估微观结构、生化成分、含水量、生物安全性、生物稳定性和机械性能来评估其性能。本研究也探索了生物支架对于ADSCs在体外向np样分化的促进作用，及NPCS在体内动物模型中对退变髓核的再生作用。
结果：
约68%胶原和43%sgag和在30天后留在NPCS中。培养在0.02%京尼平交联NPCS中的ADSCs在第14天细胞增殖明显高于其他组。与不同浓度的京尼平交联的NPCS表现出与新鲜NP相似的含水量。当频率为0.1或1rad/s时，三组G和G的值无显著性差异。而当频率为10rad/s时，dnp的G和G值显著低于其他组。此外，10rad/s时0.02%京尼平交联npcs和新鲜np的G(分别为13.71±0.53和14.19±0.59kpa)和G(分别为6.41±0.15和6.56±0.12千帕)相似。0.02％的京尼平交联的NPCS组的Acan基因表达水平第7天高于其他两组。dNP与0.02％京尼平交联的NPCS之间第7天时Col2和Sox9的基因表达水平无显着差异。第14天时，Acan，Col2，Sox9在0.02％京尼平交联的NPCS组中基因表达水平显着高于其他组。在第16周NPCS处理的髓核的椎间盘高度指标(81%)和MRI指标(349.05±38.48)明显高于退变的髓核。在体内研究中NPCS也恢复了一部分ECM成分和退变髓核的结构。
结论：
NPCS与0.02%京尼平交联后有良好的生物和机械特性，体外研究显示NPCS具有良好的生物相容性，能够诱导ADSCs的髓核样分化和细胞外基质(ECM)合成。体内植入研究证明NPCS在所使用的动物模型中可以部分再生退变的髓核。