近年来流行病学研究表明,一些植物化学物的摄入水平与肿瘤的发生发展密切相关,并且由于其高效、低毒的特性备受关注。它们可通过抑制致癌物在体内的活化,诱导细胞保护酶,抑制炎症反应,调节免疫活动,阻滞细胞周期和促进细胞凋亡,改变信号通路等多种途径发挥抗肿瘤作用。光甘草定(Glabridin, GLA)作为甘草的主要有效成分之一,也具有广泛的药理活性,如美白、抗炎、抗菌、抗氧化、心血管和神经保护作用。进一步的研究发现,光甘草定也具有抑制肿瘤增殖、侵袭转移和血管生成等作用。肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中的一小部分具有干细胞特性的细胞群体,它们具有自我更新、高度增殖和多向分化能力,在肿瘤的发生、侵袭转移、复发及耐药等方面起着决定性的作用。肿瘤干细胞的存在很好地解释了肿瘤在治疗初期会有缩小甚至消失,但会很快复发导致患者死亡的现象。深入研究肿瘤干细胞的生物学特性以及相关信号通路并针对肿瘤干细胞寻找特异性靶向药物,成为肿瘤治疗新的理论基础和途径。miRNA可作为癌基因或抑癌基因广泛参与肿瘤发生、发展、转移等多个生物学过程并成为当前研究热点。miRNA在肿瘤干细胞中也发挥着重要的作用,目前已发现多个miRNA能够通过靶向调控多个靶基因的表达进而作用于下游的多条信号通路,最终影响肿瘤干细胞的致瘤能力并改变其恶性表型。因此,以miRNA为治疗靶点的治疗策略将成为肿瘤治疗的一个新的途径。基于以上研究背景,我们假设光甘草定可通过改变某些miRNA的表达,进而调控与肿瘤干细胞特性相关的信号通路从而发挥抑制肿瘤干细胞样特性的作用,为光甘草定在肿瘤预防及治疗的应用提供科学依据。目的：本研究采用人乳腺癌细胞(MDA-MB-231、Hs-578T)和人肝癌细胞(HepG2、MHCC97H、Huh7)为体外模型,以MDA-MB-231细胞接种裸鼠形成的移植瘤为体内模型,探讨光甘草定能否通过miRNA抑制肿瘤干细胞样特性发挥抗肿瘤作用。方法：采用RT-PCR及qRT-PCR检测光甘草定对miR-148a、肿瘤干细胞表面抗原的影响；采用流式细胞术、软琼脂集落实验及悬浮球形成实验分别检测肿瘤细胞的侧群细胞比例、增殖程度及自我更新能力；采用qRT-PCR及Western Blot检测TGF-p信号通路中SMAD2的表达和磷酸化水平,以及snail的表达;采用双荧光素酶报告基因实验检测miR-148a对SMAD2的靶向抑制作用；采用甲基化特异性PCR检测光甘草定对miR-148a启动子区甲基化水平的影响；用免疫组化检测SMAD2的组织表达及定位情况。结果：1.光甘草定对肿瘤干细胞样特性的影响用10 mM GLA分别处理乳腺癌MDA-MB-231细胞0、24、48和72 h后,乳腺癌肿瘤干细胞表面抗原(CD44和ALDH-1)、自我更新指标(Oct-4和BMI-1)的mRNA表达呈时间依赖性下降；0、10、20 μM GLA处理肝癌HepG2细胞72 h后,肝癌HepG2细胞的肿瘤干细胞表面抗原(CD44、EpCAM、CD133和CD90)、自我更新指标(Oct-4和BMI-1)的mRNA表达呈剂量依赖性下降;在肝癌Huh-7和MHCC97H细胞中,GLA同样抑制CD44和EpCAM的mRNA表达；10 pM GLA处理乳腺癌MDA-MB-231细胞72 h后,侧群细胞比例、软琼脂集落及悬浮球形成数明显下降；在肝癌中,20 μM GLA抑制HepG2和MHCC97H细胞软琼脂集落形成以及HepG2和Huh-7细胞悬浮球形成能力。2. TGF-β信号通路在肿瘤干细胞样特性中的作用10ng/mL TGF-β处理肝癌HepG2细胞48 h,可明显上调肝癌HepG2细胞的干细胞表面抗原(CD44和EpCAM)的mRNA表达以及明显增加软琼脂集落和悬浮球形成数量。用SMAD2-siRNA转染肝癌HepG2细胞12 h后,再加入10 ng/mL TGF-β处理48h,发现TGF-β处理下的肝癌HepG2细胞的干细胞表面抗原(CD44和EpCAM)的mRNA表达下降；软琼脂集落形成数和悬浮球形成数量均有减少。3.光甘草定对TGF-β信号通路的影响10μM GLA处理乳腺癌MDA-MB-231细胞72 h后,再加入10 ng/mL TGF-p处理12h后,结果发现,GLA降低了TGF-β诱导的p-SMAD2; 10μM GLA处理HepG2细胞72 h后,再加入10 ng/mL TGF-β处理12h后,结果发现,GLA降低了TGF-β诱导的P-SMAD2及Snail的表达；同时,GLA抑制了SMAD2总蛋白及mRNA的表达。用10 μM GLA处理乳腺癌MDA-MB-231细胞0、24、48和72 h后,p-SMAD2及总SMAD2的蛋白及RNA水平呈剂量依赖性降低;在肝癌HepG2细胞中用0、10或20 μM GLA处理HepG2细胞72 h后,p-SMAD2及总SMAD2的蛋白水平以及SMAD2及其下游Snail mRNA的表达降低；同时,GLA抑制了Huh-7和MHCC97H细胞中SMA1(?)2及Snail mRNA的表达。4.光甘草定对miR-148a表达的影响在MDA-MB-231细胞中,]mimic-148a/WT质粒共转染组细胞的相对荧光强度比Con-mimic/WT质粒共转染组细胞明显下降,而mimic-148a/MT质粒共转染组细胞的相对荧光强度与Con-mimic/MT质粒共转染组细胞相比无明显改变。mimic-miR-148a转染肝癌Huh-7细胞后,miR-148a表达升高的同时SMAD2 mRNA及蛋白表达均下降。10μM GLA处理乳腺癌MDA-MB-231和Hs-578T细胞0、24、48和72 h后,可时间依赖性上调miR-148a的表达。在肝癌HepG2、Huh-7、MHCC97H细胞中,20μM GLA均可上调miR-148a的表达。5.光甘草定对miR-148a启动子区甲基化的影响10μM GLA分别处理乳腺癌MDA-MB-231细胞72h,qMSP结果发现,GLA处理后miR-148a的甲基化水平下降；同时,DNA甲基转移酶(DNMT1、DNMT3a)表达受抑制。6.光甘草定通过miR-148a抑制TGF-β信号通路在乳腺癌MDA-MB-231、Hs-578T细胞和肝癌HepG2细胞中分别转染anti-miR-148a抑制miR-148a的表达,再加入GLA处理,结果发现GLA对miR-148a的上调作用被削弱,对SMAD2 mRNA、p-SMAD2及SMAD2总蛋白表达的抑制作用也被削弱。7. miR-148a在光甘草定抑制肿瘤间质特征中的作用在乳腺癌MDA-MB-231细胞中,用anti-miR-148a抑制miR-148a表达后,可削弱GLA对Vimentin的抑制作用和对ZO-1及E-cadherin的上调作用。8. miR-148a在光甘草定抑制肿瘤干细胞样特性中的作用在乳腺癌MDA-MB-231、Hs-578T细胞和肝癌HepG2、Huh-7细胞中分别转染anti-miR-148a可阻滞GLA对肿瘤干细胞表面抗原(CD44、ALDH-1、 EpCAM)的下调作用,同时受GLA抑制的侧群细胞比例、软琼脂集落和悬浮球形成数量重新上调。9.光甘草定在裸鼠移植瘤模型中调控肿瘤干细胞样特性在裸鼠皮下乳腺癌移植瘤模型中发现GLA抑制裸鼠移植瘤的生长；乳腺癌肿瘤干细胞表面抗原(CD44和ALDH-1)和自我更新指标(Oct-4和BMI-1)均有不同程度下降;miR-148a的水平明显上调,且miR-148a启动子区的甲基化水平降低；DNA甲基转移酶(DNMT1、DNMT3a)的表达也受到抑制；组织内SMAD2 mRNA及蛋白的表达明显下调。结论：本研究从体外细胞模型和体内移植瘤模型中发现,光甘草定可通过去甲基化作用上调miR-148a的表达,通过miR-148a靶向抑制SMAD2的表达从而抑制TGF-β信号通路,进而抑制肿瘤干细胞样特性。