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紫杉醇(Paclitaxel)是一种广谱抗肿瘤药物,是获得FDA批准的第一个来自天然植物的化学药物。但紫杉醇水溶性差、吸收不好的缺点却限制了它在临床上的应用。聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)具有良好的生物相容性,是经FDA批准的极少数注射用高分子聚合物之一。在诸多水溶性高分子聚合物中,PEG免疫原性最低、遮蔽免疫系统的能力最强,所以其在高分子药物的发展史上具有举足轻重的地位。目前,多种PEG化的药物或药物输送体系已经商品化或者进入临床研究阶段,PEG化后的药物在体内的药代动力学过程一定会发生明显的变化。因此,药物及药物输送载体的PEG化,向我们提出了一系列不同于药物本身的、与药理毒理密切相关的药动力学关键科学问题,有待于我们去探索。本研究提出了对纳米制剂(Nanoparticle,NP)进行药物代谢动力学评价应以体内释放的游离药物作为评价基础的观点。通过对纳米制剂在体内释放出游离药物的吸收、分布、代谢及排泄过程的系统研究,获得NP的药代动力学信息,从而为NP的临床研究和应用提供有力的依据。本研究以纳米键合型药物PEG化紫杉醇(PEG-PTX)为模型药物,对其在大鼠体内的药动学进行研究,验证了纳米药动学理论的可行性,为PEG-PTX的纳米药动学提供了有力的数据支持,为今后纳米制剂的体内评价提供了思路。(1)PEG-PTX的分析方法PEG-PTX的定量分析有两个难点:其一,由于PEG化药物的分子量呈多分散型分布,其电荷分布错综复杂,产生的质核比不计其数,因此只能对有限的和分子量确定的待测物分析的多重反应监测(MRM)技术在PEG化药物定量研究中并不适用。其二,无论是水溶性药物还是脂溶性药物,一旦PEG化后在体内的药代动力学过程一定会发生明显的变化,例如血液循环时间的延长、网状内皮系统摄取量的降低、药物的释放速率的降低等;直接PEG化的小分子药物往往相当于一种“前药”,PEG-PTX给药后在机体内以PEG、PEG-PTX和PTX三种形式存在。所以,药物PEG化后会带来一系列不同于药物分子本身的、与药理毒理密切相关的药代动力学关键问题。串联四级杆-飞行时间质谱(TOF-MS)中的MSAll技术为我们提供了定量PEG-PTX的可能:Q1将PEG-PTX的所有母离子输送到碰撞反应池中,调整适当参数将母离子打碎,筛选出我们需要的待测物特征性碎片,这些碎片被输送到TOF质量分析器,最终实现PEG-PTX的定量。我们应用液相串联飞行时间质谱(LC-Q-TOF-MS/MS)技术实现了对大鼠生物基质内PEG、PEG-PTX和PTX的定量分析,并对PEG、PEG-PTX和PTX在大鼠血浆、组织、尿液和粪便生物基质中进行了方法验证,结果说明该定量方法重现性好、提取回收率高、受生物基质影响小、在整个生物样品分析周期内稳定。(2)PEG-PTX的大鼠血浆药代动力学研究本文建立分析大鼠血浆中游离药物浓度的预处理方法,开发并验证了同时测定PEG-PTX及其释放出的PEG和PTX的LC-Q-TOF-MS/MS方法。对PEG-PTX在大鼠血浆中的纳米药动学进行了研究。结果表明:PEG-PTX的半衰期是普通制剂的3倍,PEG-PTX释放的R-PTX(Released Paclitaxal)的半衰期是普通制剂的2倍,PEG-PTX提高了PTX在机体内的长循环时间,实现了长效抗肿瘤的效果。R-PTX的药时曲线下面积(Area under the concentration-time curve,AUC)是普通制剂的一半,说明PEG-PTX与普通制剂相比能够减少PTX的毒副作用。普通制剂给药后的血浆清除率为18.79 m L/kg,PEG-PTX的血浆清除率为12.83m L/kg,说明PEG-PTX减少了机体对药物的清除作用,延长了PEG-PTX在体内的作用时间。最终结果表明:PEG-PTX实现了纳米药物在机体内的长循环,降低了游离药物在大鼠血浆中的浓度,减轻了药物的毒副作用。(3)PEG-PTX的大鼠组织分布研究本文建立了分离大鼠组织中R-PTX的预处理方法及同时测定大鼠组织中PEG,PEG-PTX和PTX的分析方法,并对PEG-PTX组织水平的药物释放与分布进行了研究。相比于普通制剂,PEG-PTX在给药后降低了R-PTX在脾脏内的浓度,说明PEG-PTX不易被网状内皮系统或者免疫系统识别和清除。给药后,PEG-PTX在胃肠道组织和肌肉组织内释放的游离药物浓度均比普通制剂低,说明PEG-PTX可以有效地减少普通制剂带来的胃肠道反应,因而减缓了肌肉关节疼痛等毒副作用。(4)PEG-PTX的在大鼠体内的代谢研究本文采用LC-Q-TOF-MS/MS方法对静注PEG-PTX和PTX后大鼠尿液和粪便中的代谢产物进行鉴定,结果表明:PEG-PTX和PTX在大鼠体内经历广泛代谢:PEG-PTX在体内酶的作用下生成PTX及PTX的羧基衍生物;PTX在体内被氧化成6α-羟基PTX和3’-p-羟基PTX。(5)PEG-PTX的在大鼠体内的排泄研究本文建立了同时测定大鼠尿液和粪便中PEG、PEG-PTX及PTX的LC-Q-TOF-MS/MS方法,并对PEG-PTX给药后的排泄状况和普通制剂的异同进行了比对研究。普通制剂给药后120 h内,PTX经尿液累积排泄了6.74%,经粪便累积排泄了12.95%。PEG-PTX给药后120 h内,R-PTX经尿液累积排泄了2.47%,经粪便累积排泄了5.10%。这提示:紫杉醇在PEG化后,分子量变大,肾小球滤过作用排出体外的过程受阻,使肾小球对PEG-PTX的滤过速率变慢,这也是PEG-PTX具有长循环作用的主要原因之一。