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细胞凋亡(Apoptosis)是一种由于死亡信号触发或自身遗传基因控制所引起的主动死亡过程,对调控生物体的生长发育、细胞更新及保持机体内环境的稳态具有十分重要的作用。研究表明,缺血性心脏病的病理过程中伴随着心肌细胞调亡。目前,临床上治疗缺血性心脏病的药物主要有血管紧张素抑制剂、β-肾上腺素受体阻断药、硝酸酯类及钙通道阻滞剂。化学药物见效快、作用靶点明确,但往往伴有一定的副作用,影响药物的疗效。近年来,诸多中医药工作者致力于抗心肌缺血研究,在中医药治疗缺血性心脏病方面积累了丰富的经验,证实许多中药或提取物具备多种生理活性,同时还具有不良反应少、安全性高的优点。大蒜辣素是国际公认的大蒜主要活性成分,由蒜氨酸和蒜酶发生催化裂解反应而产生。研究表明,大蒜辣素具有多种心血管保护作用,如抗氧化、降血脂、改善心肌纤维化等,是当前心血管领域极具研究价值和开发前景的植物活性成分。然而关于大蒜辣素抗心肌缺血作用及机制的报道较少。实验部分目的:制作体内外心肌缺血模型,观察大蒜辣素对心肌缺血后细胞凋亡的保护作用,并进一步探讨其可能的分子机制。方法:实验一1.通过结扎大鼠冠状动脉左前降支法制作急性心梗模型。将大鼠随机分为6组:①假手术组;②模型组;③盐酸地尔硫草注射液阳性对照组(1.5mg/kg);④大蒜辣素注射液低剂量组(1.2 mg/kg);⑤大蒜辣素注射液中剂量组(1.8mg/kg);⑥大蒜辣素注射液高剂量组(3.6mg/kg)。腹腔注射给药3周后,取材。2.采用HE染色法检测组织病理学特征;采用试剂盒检测血清中CK、LDH、MDA、SOD的含量或活性;亚甲蓝光谱法检测血浆中H2S水平;TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况;Western Blot及RT-PCR法检测Bax和Bcl-2蛋白表达情况及mRNA的含量。实验二1.选用H9c2细胞系为研究对象,给予不同剂量的大蒜辣素(0.1～100μM)处理12h后,采用MTT法检测大蒜辣素对正常H9c2细胞活力的影响,确定大蒜辣素的给药剂量。2.制备心肌细胞缺血缺氧模型,将H9c2细胞培养于37℃、5%CO2的三气培养箱中,通入纯度为95%的N2平衡培养箱中的02,使排气口检测O2浓度≤1%。3.将H9c2细胞分为5组:①空白对照组;②缺血缺氧模型组;③大蒜辣素注射液低剂量组(0.2μM);④大蒜辣素注射液中剂量组(1μM);⑤大蒜辣素注射液高剂量组(5μM)。于倒置显微镜下观察细胞的形态;MTT法检测细胞活力;Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡情况;荧光剂标记法检测细胞内的钙离子浓度;JC-1法检测细胞内线粒体膜电位变化;采用试剂盒检测细胞内MDA含量和SOD活性;Western Blot法检测Bax、Bcl-2、Caspase-3、Nrf2 及 HO-1 蛋白的表达。4.为探讨大蒜辣素抗细胞凋亡作用与H2S的关系,使用了 H2S合成酶抑制剂PAG。将H9c2细胞分为4组:①缺血缺氧模型组;②大蒜辣素注射液组(5μM);③大蒜辣素注射液(5μM)+PAG组;④PAG组。采用Western Blot法检测Bax和Bcl-2蛋白的表达。5.为探讨大蒜辣素药理作用与NO的关系,本研究使用了 NO合成酶的抑制剂LNAME。将H9c2细胞分为4组:①缺血缺氧模型组;②大蒜辣素注射液组(5μM);③大蒜辣素注射液(5μM)+LNAME组;④LNAME组。检测细胞内NO的含量;Western Blot法检测eNOS、Bax及Bcl-2蛋白的表达。结果:实验一1.假手术组心肌纤维排列整齐,心肌间质未出现明显炎症细胞浸润;模型组心肌细胞结构紊乱,空泡变形、肿胀,心肌纤维化,甚至可见局灶性坏死区;而阳性药对照组和大蒜辣素给药组,纤维化程度明显减轻,心肌局灶性坏死减少,心肌细胞核大小均匀,未见明显肿胀。2.与假手术组相比,模型组CK的含量显著升高(P<0.05),LDH的含量有升高趋势(P>0.05)。与模型组相比,阳性药对照组和大蒜辣素给药组CK及LDH的含量均显著降低(P<0.05)。同时,阳性对照组和大蒜辣素给药组,MDA含量均显著降低,SOD活性均明显升高(P<0.05)。3.与未给予大蒜辣素组相比,大蒜辣素给药组血浆中H2S的含量均显著升高(P<0.05),且呈剂量依赖关系。4.与假手术组相比,模型组细胞凋亡指数明显升高(P<0.05);而阳性对照组和大蒜辣素给药组心肌细胞凋亡指数均显著降低(P<0.05)。5.与假手术组相比,模型组Bax蛋白及mRNA水平均明显升高(户<0.05),而Bcl-2蛋白及mRNA水平均明显下降(P<0.05)。与模型组相比,大蒜辣素高剂量组Bax蛋白及mRNA水平均明显下降,中剂量和高剂量组Bcl-2蛋白及mRNA水平均明显升高(P<0.05),但大蒜辣素低剂量组Bax、Bcl-2蛋白及mRNA的差异均无统计学意义(P>0.05)。实验二1.大蒜辣素对正常H9c2细胞的影响与Control组比较,大蒜辣素的给药剂量在0.1～10μM区间内,H9c2细胞活性没有显著性差异(P>0.05)。当大蒜辣素的给药剂量达到25～100μM时,H9c2细胞的活性明显降低(P<0.05)。2.大蒜辣素对H9c2细胞凋亡的影响2.1镜下观察显示,Control组细胞生长状态良好,细胞形态清晰完整,呈梭形。单纯I/H组细胞受损严重,细胞边缘模糊,部分细胞皱缩变圆,脱落,漂浮在培养基中。与单纯I/H相比,大蒜辣素预处理组细胞受损程度减轻,细胞状态有明显改善,皱缩脱落、漂浮在培养基中的细胞数量减少。2.2与Control组相比,单纯I/H组细胞的活力明显降低,且差异有统计学意义(P<0.05),表明心肌细胞缺血缺氧损伤模型制作成功。与单纯I/H组进行比较,大蒜辣素给药组细胞活力均升高,且差异有统计学意义(P<0.05)。2.3与Control组相比,单纯I/H组细胞的凋亡率显著增加(P<0.05)。与单纯I/H组相比,大蒜辣素给药组细胞的凋亡率均显著降低(P<0.05)。2.4与Control组相比,单纯I/H组细胞中Ca2+水平明显增加(P<0.05),表明H9c2细胞出现Ca2+超载。而大蒜辣素给药组细胞内Ca2+水平均明显降低,且呈剂量依赖关系。与单纯I/H组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。2.5 Control组JC主要以聚合物形式存在,细胞呈现红色荧光,而绿色荧光很弱;单纯I/H组JC-1主要以单体形式存在,细胞的绿色荧光非常强,而红色荧光很弱,表明单纯I/H组细胞内的线粒体膜电位降低。与单纯I/H组相比,大蒜辣素(5μM)处理组细胞的绿色荧光减弱,红色荧光增强。2.6与Control组相比,单纯I/H组细胞中Bax、Caspase-3蛋白表达明显升高(P<0.05),而Bcl-2蛋白表达明显下降(P<0.05)。与单纯I/H组相比,大蒜辣素(5μM)给药组Bax、Caspase-3蛋白水平明显下降(P<0.05);大蒜辣素(1μM、5μM)给药组Bcl-2蛋白水平均明显升高(P<0.05)。3.大蒜辣素抗H9c2细胞凋亡作用与H2S的关系加入H2S合成酶抑制剂PAG后,大蒜辣素对Bax、Bcl-2蛋白的调控作用被明显抑制;而单用PAG组,细胞中Bax和Bcl-2蛋白的表达量变化不明显,与I/H组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。4.大蒜辣素抗H9c2细胞凋亡作用与NO的关系与Control组相比,单纯I/H组细胞NO含量和eNOS的表达量降低,且差异有统计学意义(P<0.05)。与单纯I/H组相比,大蒜辣素预处理组心肌细胞NO含量和eNOS表达量显著增加(P<0.05)。加入NO合成酶抑制剂LNAME后,大蒜辣素的上述作用被明显抑制。同时,加入LNAME后,大蒜辣素调控Bcl-2和Bax的作用也被明显抑制,而单用LNAME组,差异无统计学意义(P>0.05)。5.大蒜辣素抗H9c2细胞凋亡与氧化应激的关系与Control组相比,单纯I/H组细胞中MDA的含量显著升高,SOD的活性明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与单纯I/H组相比,大蒜辣素(1μM、5μM)给药组可显著降低MDA的含量;大蒜辣素(0.2μM、5μM)给药组还可显著提高SOD的活性(P<0.05);表明大蒜辣素具有抗氧化作用。与Control组相比,单纯I/H组H9c2细胞中Nrf2表达呈现升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);而HO-1表达量显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与单纯I/H组相比,大蒜辣素给药组Nrf2的表达均升高,尤其以大蒜辣素(1μM、5μM)给药组升高明显,差异均有统计学意义(P<0.05);大蒜辣素给药组HO-1的表达量均呈现升高趋势,尤其以大蒜辣素(1μM、5μM)给药组升高明显(P<0.05),表明大蒜辣素具有抗氧化应激作用。结论:1.大蒜辣素能够改善缺血模型大鼠心肌组织形态学特征,减少CK、LDH酶的渗出,降低心肌组织TUNEL染色阳性细胞数,抑制促凋亡蛋白Bax及mRNA表达,同时促进抗调亡蛋白Bcl-2及mRNA表达,表明大蒜辣素对心肌缺血诱导的细胞凋亡具有抑制作用。2.缺血缺氧环境可诱导H9c2细胞发生调亡,主要表现为:细胞活力下降,细胞调亡率增加,细胞内Ca2+超载,线粒体膜电位下降,促凋亡蛋白Bax及Caspase-3的表达升高,抗调亡蛋白Bcl-2的表达降低。3.大蒜辣素能够增强H9c2细胞活力,减少缺血缺氧诱导的H9c2心肌细胞凋亡,同时能够抑制细胞内Ca2+超载和线粒体膜电位降低,下调Bax、Caspase-3蛋白表达以及促进Bcl-2蛋白表达,表明大蒜辣素在体外能够抑制心肌细胞凋亡。4.大蒜辣素能够抑制Bax蛋白表达及促进Bcl-2蛋白表达,而H2S合成酶抑制剂PAG能逆转大蒜辣素抗细胞凋亡作用,表明大蒜辣素的抗细胞凋亡作用可能与H2S信号分子相关。5.大蒜辣素能够上调缺血缺氧模型H9c2细胞内eNOS蛋白的表达水平,提高细胞内NO的含量。而NO合成酶抑制剂能够逆转大蒜辣素调节细胞凋亡相关蛋白的作用,表明大蒜辣素的抗细胞凋亡作用可能与激活内源性保护通路eNOS/NO有关。6.大蒜辣素能够有效降低H9c2细胞中MDA含量,显著升高SOD活性,促进Nrf2合成和核转位、进而促进下游抗氧化蛋白HO-1的表达,表明大蒜辣素的抗凋亡作用可能与激活Nrf2/HO-1抗氧化应激信号通路有关。