研究背景和目的结直肠癌是世界上常见的恶性肿瘤之一,目前对结直肠癌的治疗以手术为主,辅以放化疗,但疗效欠佳,其5年生存率仍只在50%-70%,而中晚期结直肠癌治疗效果更差。转移是影响患者疗效和死亡的主要原因,临床上多数结直肠癌患者在进行根治性手术前已出现微转移,并且是结直肠癌术后转移和复发的直接原因。但目前缺乏检测微转移的有效方法,因此对结直肠癌转移的分子机制进行深入研究,是结直肠癌研究的重要内容。MicroRNA (miRNA)是一种大小约19-25个碱基的非编码微小RNA。近年来的究显示,miRNA通过抑制特定的癌基因或抑癌基因,在肿瘤的发生发展中起着重要作,目前miRNA在肿瘤中的研究已成为一个新热点。大量文献报道人类癌症中存在miRNA的异常表达,例如在乳腺癌、结直肠癌等多种癌症中miRNA的差异表达谱相继被报道。miRNA对基因的转录后表达调控是21世纪的一个突破性科学发现,miRNA通过靶定癌基因或肿瘤抑癌基因,发挥着类似肿瘤抑制因子或癌基因的作用,参与肿瘤的转化、生长、血管生成及EMT等多种过程。miRNA与其调控的mRNA并非一对一的关系,每个miRNA有许多靶点mRNA,而每个mRNA受多种miRNA的调节,两者之间形成一个复杂和相互关联的调控网络。本课题利用miRNA芯片从结直肠癌组织中筛选出miR-223作为结直肠癌转移候选miRNA,明确miR-223在结直肠癌侵袭、转移中的作用,主要内容如下：(1)筛选及验证结直肠癌转移相关的miRNA;(2)预测及鉴定miR-223的靶基因,明确其在结直肠癌侵袭和转移的作用；(3)确定miR-223的上游调控因子,探讨两者间的相互调控关系。本课题旨在揭示一个新的miR-223表达调控机制,阐明miR-223在结直肠癌演进中的作用机制,为临床抗结直肠癌侵袭、转移提供新的miRNA和基因靶点。研究方法1、结直肠癌中异常表达miRNAs筛选及验证采用生物芯片初步筛选在结直肠癌组织中表达明显改变的转移相关miRNAS并且利用荧光定量PCR验证miR-223在结直肠癌组织中的表达情况。2、miR-223的作用靶点的预测及鉴定以miR-223为检索词,利用数据库MiRanda、TargetScan、DIANA-microT、 Pictar、及RNAhybrid对miR-223的靶基因进行预测,挑选软件交集较多及预测值较高的靶点,即FBXO8作为研究对象,利用双荧光素酶报告基因检测进行鉴定,最后利用荧光定量、western blot分别检测miR-223和靶基因的表达,并且进行性关性分析。3、miR-223对结直肠癌细胞生物学行为的影响(1)利用阳离子脂质体法,将miR-223inhibitor瞬时转染至结直肠癌细胞株SW620和SW480中,利用western blot检测FBX08的表达变化；(2)设计并构建miR-223慢病毒表达载体,进行病毒包装,感染至结直肠癌细胞株HT29及SW480中,经流式分选构建稳定表达的细胞株,利用Western blot检测FBX08蛋白的表达变化；(3)将miR-223慢病毒表达载体和不含3’UTR的FBX08编码区表达慢病毒载体共转染至结直肠癌细胞株HT29及SW480中,构建稳定表达的细胞株,利用Western blot检测FBX08的表达变化；(4)利用MTT法、细胞凋亡检测和体外侵袭实验,检测miR-223抑制后对体外结直肠癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响；(5)利用MTT法、平板克隆形成、细胞凋亡检测和体外侵袭实验,检测miR-223表达载体及miR-223和FBX08(不含3’UTR)共表达载体转染后对体外癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响；(6)利用整体可视化动物模型,检测miR-223表达载体及靶点miR-223和FBX08(不含3’UTR)共表达载体转染后对裸鼠皮下成瘤能力的影响；(7)利用免疫组化检测FBX08在结直肠癌组织中表达情况。4、miR-223上游调控因子的预测及验证寻找miR-223上游启动子的基因组序列,利用软件预测可能的上游转录因子,利用荧光素酶报告基因实验检测转录因子对miR-223启动子转录活性的影响,并用染色质免疫共沉淀(chip)验证两者之间的结合位点；改变细胞内转录因子的表达水平后检测miR-223表达水平的改变。研究结果1.结直肠癌转移相关miRNA的筛选及鉴定(1)送检的4张芯片结果提示,在癌组织及转移组(淋巴结转移及远处转移)中表达均上调的共筛选出42个miRNA,其中包括miR-223。miR-223在肿瘤转移组中表达明显增高。(2)利用荧光定量PCR检测62对配对结直肠癌组织中miR-223的表达,2-△△Ct值通过配对T检验及单因素方差分析结果显示：结直肠癌组织组中miR-223表达间差异显著(t=4.498, P<0.001), miR-223在结直肠癌组织中的表达明显高于正常粘膜组织；进一步将结直肠癌组织分为伴有淋巴结或远处转移组及不伴有转移组,比较发现,miR-223在伴有淋巴结或远处转移的结直肠癌组织和不伴有转移的结直肠癌组织之间的表达有明显差异(F=2.730,P=0.009)。2、miR-223的作用靶点的预测及鉴定(1) miRNA-223相关靶基因的生物信息学预测通过五个常用预测数据库预测miR-223相互作用的靶基因,结果显示FBX08和RHOB(5个软件均预测)预测值较高,于是我们选定了FBXO8作为miR-223的靶基因,选择RHOB作为靶基因预测的鉴定。(2)在HEK293A细胞及SW480细胞中,分别转染psiCHECKTM-2-FBXO8-3’UTR载体及psiCHECKTM-2-RHOB-3’UTR,结果显示：miR-223组与blank组、NC组相比荧光素酶活性均显著降低(F=85.465,P<0.001,F=41.04,P<0.001；F=32.283,P<0.001,F=208.981,P<0.001),说明miR-223分别能与FBXO8及RHOB基因3’UTR结合,从而抑制了荧光素酶的活性。(3)利用荧光定量PCR检测miR-223在6种结直肠癌细胞株中的表达,以lovo细胞为对照(mean±SD:1±0.000),单因素方差分析显示,miR-223在5种细胞株间的表达具有显著差异(F=84.937,P<0.001)。两两比较显示miR-223在SW480细胞中的表达最高,且显著高于SW620、HT29、HCT116及LS174T细胞中的表达(P=0.001,P=0.004,P=0.011,P=0.006)。(4)利用Western blot检测FBXO8在6种结直肠癌细胞株中的表达,结果显示FBXO8在HCT116细胞中的表达最高,在SW620、LS174t、HT29、LOVO和SW480的表达逐渐降低；RHOB在SW620、HCT116和LS174t的表达量均较高,而在其它细胞株中表达较少。(5)利用Quantity One灰度软件将FBXO8蛋白的Western blot结果进行条带灰度分析,然后与miR-223荧光定量PCR结果进行Spearman相关性分析,结果显示在检测的6种结直肠癌细胞株之间miR-223与FBXO8之间不存在相关性(r=0.200,P=0.704),然而其中四种细胞株分别为SW620、SW480、HT29及LS174T,二者存在显著的负相关关系(r=-1.000,P<0.001)。同样方法检测6种结直肠癌细胞株中miR-223与RhoB之间的相关性分析,结果显示6种细胞中两者之间的表达不存在相关性(r=—0.257,P=0.623),然而其中四种细胞株分别为SW620、SW480、HT29及LS174T中二者存在显著的负相关关系(r=—1.000,P<0.001)。3.MiR-223对结直肠癌细胞生物学行为的影响3.1miR-223inhibitor转染后对结直肠癌细胞生物学行为的影响(1)SW480及SW620细胞在miR-223inhibitor处理之后与NC组及Blank组相比,FBX08的表达量明显上调,说明将miR-223抑制后,能够上调FBX08蛋白的表达。(2)采用MTT比色法对miR-223抑制后细胞的体外增殖能力变化进行检测,并绘制生长曲线。析因方差分析结果显示：SW480细胞生长时间水平差异具有显著性(F=193.744,P<0.001),细胞增殖能力组间差异具无显著性(F=1.719P=0.194)；时间与组间交互效应无显著性差异(F=0.692,P=0.725)；SW620细胞生长时间水平差异具有显著性(F=762.667,P<0.001),细胞增殖能力组间差异无显著性(F=1.863,P=0.17),时间与组间交互效应无显著性差异(F=0.676,P=0.739)。结果提示,与blank组和nc组相比,miR-223inhibitor组的增殖速度没有明显改变,说明抑制miR-223之后对细胞的体外增殖能力没有影响。(3)利用Boyden侵袭小室检测miR-223inhiibitor处理后,SW480和SW620细胞的体外侵袭能力变化。单因素方差分析结果显示,SW480和SW620细胞中miR-223inhibitor处理组、NC组和Blank组间的细胞侵袭能力的差异具有显著性(F=30.545,P<0.001；F=37.954,P<0.001)。与Blank组和NC组相比,miR-223inhibitor处理后SW480和SW620细胞的穿膜数目明显减少(P<0.001；P<0.001),说明抑制miR-223后癌细胞的体外侵袭能力有所减弱。(4)使用流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示,转染了miR-223-inhibitor后,SW480及SW620细胞凋亡的比例分别为4.16%和0.84%,NC组细胞凋亡的比例分别为4.36%和0.65%相比,两组之间凋亡比例没有明显的变化(P=0.737；P=0.340)。3.2miR-223过表达后对结直肠癌生物学行为的影响(1)采用荧光定量PCR检测HT29和SW480细胞中miR-223过表达组、NC对照组、Blank对照组和miR-223/FBXO8共转染组的miR-223表达变化,以blank组为对照(mean±SD为1.0004±0.000),经单因素方差分析检测,结果显示HT29和SW480细胞株中三组间差异均具有显著性(F=13.719,P=0.006；F=27.865,P=0.001)。对HT29细胞株中4组进行两两比较,结果显示,miR-223的表达在miR-223转染组明显高于NC和blank对照组(P=0.001,P=0.001),而miR-223/FBXO8共转染组与miR-223转染组相比无明显差异(P=0.902)。对SW480细胞株中4组进行两两比较,结果显示,miR-223在miR-223转染组中的表达明显高于NC和blank对照组(P=0.001,P<0.001),而miR-223/FBXO8共转染组与miR-223转染组相比无明显差异(P=0.340),以上说明miR-223转染成功,且FBX08重新导入后,对miR-223的表达没有明显影响。(2)利用Western blot检测HT29和SW480细胞中NC对照、blank对照、miR-223转染组和miR-223/FBXO8共转染组的FBX08蛋白表达变化,结果显示在HT29和SW480细胞中, FBX08蛋白在miR-223转染组中的表达与NC和blank对照组相比明显下调,而重新导入FBX08后,FBX08蛋白表达又上调。以上结果说明miR-223转染能下调FBX08蛋白的表达,而miR-223/FBXO8共表达能有效逆转FBX08的表达下调。(3)采用MTT比色法检测HT29和SW480细胞中blank对照、NC对照、miR-223转染组和miR-223/FBXO8共转染组的体外增殖能力,并绘制细胞生长曲线。析因设计方差分析结果显示：HT29和SW480细胞中4个组的生长时间水平差异有显著性(F=2013.235,P<0.001；F=1492.857,P<0.001),组间细胞增殖能力有明显差异(F=71.675,P<0.001；F=336.129,P<0.001),时间与分组之间交互效应显著(F=32.413,P<0.001；F=10.937,P<0.001)。多重比较的结果显示,miR-223转染组、NC对照、blank对照之间细胞的增值能力无显著性差异(P=0.266, P=0.873, P=0.204; P=0.242, P=0.133, P=0.202),而miR-223/FBXO8共转染组细胞的增值能力明显减弱(P<0.001；P<0.001),以上结果说明miR-223对细胞体外增殖能力并无明显作用。(4)利用平板克隆形成实验检测两种细胞株中miR-223组、miR-223/FBXO8组、blank和NC组细胞体外增殖能力的变化,统计结果显示,HT29和SW480细胞株中4组细胞间的克隆形成能力无显著差异(F=0.566,P=0.653；F=0.613,P=0.625)。(5)利用Boyden侵袭小室检测两种细胞株中miR-223组、NC组、blank和miR-223/FBXO8组细胞的体外侵袭能力变化,统计结果显示,HT29和SW480细胞株中4组别间细胞的侵袭能力具有显著性差异(F=51.054,P<0.001；F=104.515,P<0.001)。两两比较结果显示,在HT29细胞株中,miR-223组细胞穿膜数目比blank组、NC组和miR-223/FBXO8组显著增多(P<0.001,P<0.001,P<0.001)。在SW480细胞株中,miR-223组细胞穿膜数目比blank组、NC组和miR-223/FBXO8组明显增多(P<0.001,P<0.001,P<0.001)。(6)使用流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示,转染了miR-223-mimics后,SW480及HT29细胞中,miR-223过表达组与NC组之间细胞凋亡率没有统计学差异(P=0.948,P=0.288)。(7)利用WB检测HT29、SW480细胞中miR-223组、NC组及blank组的Snail、Vimentin、Slug及α-cantenin的表达情况,结果显示,与NC和blank组相比,miR-223组细胞中EMT相关标志物的表达无明显改变；(8)miR-223组、NC组、blank和miR-223/FBXO8组四组细胞的皮下成瘤能力具有明显差异(F=89.535,P<0.001)。两两比较后发现,miR-223组与blank组、NC组和miR-223/FBXO8组相比皮下肿瘤生长速度明显增快(P<0.001,P<0.001, P<0.001), miR-223/FBXO8组的皮下肿瘤生长速度明显慢于miR-223组(P<0.001)。3.3免疫组化检测FBXO8在结直肠组织中的表达(1)利用免疫组化检测了203对结直肠癌组织及配对的正常组织,结果显示,FBXO8在正常组织中的表达明显高于癌组织中的表达(P<0.001,z=-9.236)；在203例癌组织中,伴有淋巴结转移和不伴有淋巴结转移的癌组织分别为77例和126例,两者间的表达不具有统计学差异(P=1.000)；FBXO8在正常组织、癌组织及淋巴结转移癌三者之间的表达具有显著性差异(P<0.001,chi-square=107.581); FBXO8的表达与患者的年龄及肿瘤的分化程度有关(P=0.002：P=0.001)。(2)生存分析发现,FBXO8低表达是患者预后较差的一个重要因素；单因素分析发现,患者的生存时间与FBX08的表达(P=0.035)、年龄(P=0.011)及淋巴指数LNR (P=0.002)之间存在显著性相关；多因素分析发现,患者的生存时间与患者的年龄(P=0.009)及淋巴指数LNR (P=0.002)之间存在显著性相关(P=0.019)。4.miR-223上游调控因子的预测及验证(1)通过Ensembl数据库,在线获得编码miR-223前体序列所在基因的上游1kb作为miR-223的启动子序列。(2)利用三种在线软件(Mapper2, Consite及TRED)预测及分析可能与miR-223启动子结合的转录因子,综合考虑选择MEF2A作为miR-223的转录因子。(3)利用双荧光素酶报告基因检测miR-223启动子和转录因子MEF2A之间的荧光素酶活性,结果显示,当SW480细胞及HEK293A细胞转染PGL3-Basic-223质粒时,与Blank组相比,其荧光素酶活性增强(P<0.001；P<0.001),说明miR-223启动子序列是有启动转录活性的；当共同转染PGL3-Basic-223和pEGFP-MEF2A时,两种细胞的荧光素酶活性较miR-223-Luc组显著增强(P<0.001；P<0.001),进一步表示MEF2A能明显促进miR-223启动子的转录活性。(4)利用染色质免疫共沉淀检测miR-223启动子和转录因子之间的结合位点,结果显示,两者之间存在着两个部位的结合,分别是R1段和R2段,作为阴性对照的IgG组没有结合位点的存在。(5)利用荧光定量检测转染MEF2A后,SW480及SW620细胞中miR-223的表达,结果显示,两种细胞中miR-223的表达较对照组明显增高(t=10.737,P=0.009；t=-52.218,P<0.001),提示MEF2A能促进miR-223的表达；利用Westernblot检测SW480及SW620细胞转染MEF2A后,对FBX08蛋白表达的影响,结果显示在转染MEF2A后,两种细胞中FBXO8蛋白表达下调,提示MEF2A能抑制FBXO8蛋白的表达；内源性MEF2A及miR-223的表达检测,每组以SW480细胞为对照(均数及标准差为1.000±0.000),经独立样本t检验结果显示,SW480及SW620中MEF2A的表达具有显著性差异(t=17.826,P<0.001)；SW480及SW620中miR-223的表达具有显著性差异(t=3.778,P=0.019),提示MEF2A在结直肠癌细胞株中表达与miR-223一致。结论1、成功筛选出115个转移相关的候选miRNAs,其中miR-223在结直肠癌组织中表达上调,在伴有淋巴结转移和远处转移组织中高表达；2、miR-223通过靶基因FBX08促进结直肠癌细胞的侵袭和体内成瘤；3、MEF2A促进miR-223在结直肠癌细胞中的表达,抑制FBX08在的表达；4、提出一个新的调控机制,即miR-223在MEF2A的转录调控下通过FBX08及ATK/mTOR通路促进结直肠癌侵袭和转移。本研究的创新之处：1、miR-223是我们前期筛选出的一个转移候选miRNA,其与结直肠癌侵袭和转移的关系尚未见报道；2、提出了一个新的miR-223表达调控的机制,选题具有很好的原始创新性和鲜明的研究特色；3、阐明miR-223/FBX08在结直肠癌侵袭和转移中的作用机制,将为肿瘤转移的诊治、预后及药物筛选提供新的基因和miRNA靶点。