一、环状RNA Circ-0008285在早期肝癌中的作用及机制的研究(一)研究背景和目的原发性肝癌是世界范围内最常见恶性肿瘤之一,其中,肝细胞性肝癌(Hepatocellular Carcinomas,HCCs,简称肝癌)是最常见的原发性肝恶性肿瘤的类型之一,它在男性恶性肿瘤中死亡率中位居第二位。我国是乙肝高发区之一,肝癌患者占世界一半以上。但是,由于HCC早期在临床上无特征性表现,就诊时往往已是中晚期。肝癌最有效的治疗手段是根治性切除,但是目前根治性切除率较低,这是肝癌预后差的主要原因之一。因此,肝癌的早期预警和早期干预有着重要的意义,进一步深入研究肝癌早期发生的分子机制以及早期诊断的改进显得尤为重要。其中,肿瘤早期发生很可能受到ce RNA的调控。“ce RNA假说”于2011年被提出后,研究人员从生物信息学、细胞生物学和动物模型等不同水平验证了该假说。ce RNA分子,比如m RNA,lnc RNA、假基因等,被认为能够通过micro RNA(miRNA)应答元件(Micro RNA Response Element,MRE)竞争结合相同的miRNA来行使调节各自表达水平的作用。基因转录后调控得到了ce RNA假说的补充,在肿瘤等疾病发生发展中提供了转录组研究的新思路。环状RNA是ce RNA家族新成员,不同于线性RNA,环状RNA没有5’末端帽子结构和3’末端多聚腺苷酸(poly A)尾巴结构,而是以共价键形成首尾相连的闭合环形结构,天然并于广泛存在于不同种族的真核细胞系中。最近,一些circ RNA已被证明含有多个保守的miRNA结合位点,可以调控基因的表达,肿瘤的发生和发展过程受到这些表观遗传学上的改变的调控。所以,深入研究HCC发生发展过程中重要信号通路以及节点分子的表达谱,将极大地促进HCC早期诊断及治疗手段的发展,具有较高的科研价值。近年来大量非编码RNA,特别是miRNA和长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA),在肝癌生物学功能调控以及肝癌临床诊断中的潜在应用受到了越来越多的关注。近年来环状RNA的发现与进一步认知,丰富了转录后翻译水平调控家族。越来越多互相作用、互相影响并且在幕后控制分子修饰与表达的环状RNA分子参与了转录后翻译水平的调控。目前,研究已发现并证实circ RNA参与多种肿瘤细胞生物学功能的调节,包括结直肠癌、食管鳞状细胞癌、胃癌、乳腺癌和基底细胞癌等等。环状RNA表达失调与多种恶性肿瘤相关,在不同肿瘤类型中,环状RNA可能起到抑癌基因或是癌基因的作用。但是,目前环状RNA参与调控肝癌早期发生及分子机理方面的报道甚少,肝癌早期相关环状RNA表达谱仍需要深入的研究。在本研究中,利用环状RNA芯片,我们对比了10对极早期(BCLC 0期)肝癌与配对癌旁新鲜组织环状RNA表达谱,并通过大样本定量检测从早期肝癌样本中筛选与早期肝癌发生相关的环状RNA,建立肝癌早期发生表型相关特征环状RNA谱,最终选取肝癌组织比癌旁组织升高表达最显著的环状RNA Circ-0008285作为候补circ RNA,探讨其作为早期肝癌发生独立预警分子和治疗靶点的应用价值。基于以上背景,我们系统研究了环状RNA Circ-0008285这一与HCC早期发生相关的特异性环状RNA在肝癌起始过程中的作用,发现其可以通过竞争性结合miR-892a上调肝癌细胞中miR-892a的靶基因HDGF表达,从而促进HCC的发生,为预测HCC提供了新思路、新方法和早期肝癌潜在治疗靶点。(二)实验方法1.通过生物芯片筛选,建立肝细胞癌差异表达circ RNA谱,确定重点研究circ RNA,利用RT-PCR的方法,结合临床大样本筛选鉴定并规模验证肝癌早期发生相关差异circ RNA;2.选取肝癌比癌旁升高表达最显著的环状RNA Circ-0008285作为候补circ RNA,进行后续功能验证;3.设计反向扩增PCR引物,产物扩增回收后结合一代测序技术明确Circ-0008285成环形式及成环序列的具体核酸信息,确认其来源母基因;4.荧光定量PCR检测现有10种肝癌细胞系(SMMU7721、Huh7、Hep G2、HCCLM3、PLC/ARF5、97H、97L等),2种相对正常肝细胞系(L02和QSG7701)和2种免疫细胞系(THP-1和U-937)中Circ-0008285的表达水平,分别确定两株高低表达Circ-0008285的肝癌细胞系用于功能分析;5.通过慢病毒表达系统构建环状RNA Circ-0008285的干扰和过表达细胞系,并检测干扰和过表达的效果;6.通过细胞核质分离实验,确认环状RNA Circ-0008285在细胞中的定位,并根据其具体定位进行相应的功能学实验;7.分别对Circ-0008285高表达细胞系使用干扰慢病毒、对Circ-0008285低表达细胞系使用过表达慢病毒,观察干预Circ-0008285后细胞干性、增殖表型的变化;8.使用上述干预手段预处理干扰Circ-0008285细胞系,通过体外以及体内有限稀释实验,研究Circ-0008285对肿瘤发生过程的影响;9.通过RT-PCR及Western Blot技术检测干扰和过表达环状RNA Circ-0008285后对其母基因线性转录本表达是否具有影响;10.结合生物信息学分析可能与Circ-0008285相互作用的miRNA,使用RNA Pulldown实验确定预测的miRNA是否与Circ-0008285发生相互作用;11.利用建立的环状RNA Circ-0008285稳定干扰肝癌细胞系(HCCLM3)进行m RNA芯片分析筛选,以期验证在肝癌细胞中哪些理论上的miRNA靶基因的表达受到Circ-0008285的调控;12.使用荧光定量PCR、Western Blot和目的基因3’非翻译区报告双荧光素基因质粒确定Circ-0008285调控关键节点基因的主要方式;13.通过生物信息学分析的与Circ-0008285相互作用的miRNA潜在靶基因中寻找可能调节关键信号通路活性的分子,干扰或过表达后通过干性表型分析确认Circ-0008285是否通过竞争性吸附miRNA、恢复相应基因表达水平、调节细胞增殖、干性表型;14.通过Western Blot实验技术研究Circ-0008285引起的信号通路分子活性改变,确认这些信号通路是否参与Circ-0008285调控的肝癌早期发生过程;(三)结果1.完成10对极早期肝癌与配对癌旁新鲜组织circ RNA异常表达分析,选取癌比癌旁升高表达最显著的Circ-0008285作为目标研究对象。2.大样本验证Circ-0008285在极早期和早期肝癌组织中表达情况,发现Circ-0008285在极早期和早期肝癌组织中普遍比相对应的癌旁组织中表达升高。3.Circ-0008285在肝癌细胞系中普遍表达较高,并主要分布于细胞质中,可以竞争性结合miR-892a,行使miRNA海绵的作用,影响其下游基因HDGF的表达。4.Circ-0008285可以促进细胞的自我更新和增殖。5.Circ-0008285在体内及体外均能够促进肝癌细胞的干性表型和肿瘤生长。6.Circ-0008285可升高肝癌细胞中HDGF的表达,增强其与膜受体NCL相互作用,激活PI3K/AKT/m TOR信号通路。7.Circ-0008285可升高肝癌细胞中HDGF的表达,增强其与膜受体NCL相互作用,激活PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin通路,促进β-catenin的核转位。(四)结论本研究通过不同临床分期的肝癌及配对癌旁样本和不同的肝癌细胞系的表达验证实验,证实在早期肝癌中环状RNA Circ-0008285的表达异常升高。环状RNA Circ-0008285可以作为miRNA海绵竞争性地结合miR-892a,促进miR-892a下游靶基因HDGF的表达升高。HDGF作为分泌性肝癌相关癌蛋白与其受体NCL结合后进入胞内,激活PI3K/AKT/m TOR通路以及PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路,提高了EPCAM+的肝肿瘤起始细胞比例,并促进了肝癌细胞的自我更新和增殖,最终促使了肝癌的发生。这些是Circ-0008285实现对肝癌发生的重要调节机制。综上所述,本研究结果提示环状RNA Circ-0008285是HCC早期诊断以及治疗的潜在干预靶点。二、核因子HMGB1在非酒精性脂肪肝发生发展中的作用及机制研究(一)研究背景和目的随着近年来世界范围内发病率的迅速上升,非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)成为了目前导致肝功能异常和慢性肝病的最常见危险因素。在美国,非酒精性脂肪肝影响到了很大一部分的人口,非酒精性脂肪肝和肝癌这两种疾病都被认为属于代谢综合征,越来越多的证据表明非酒精性脂肪肝和肝癌之间有着显著的关联。原发性肝癌是世界第六大常见恶性肿瘤,其中,肝细胞性肝癌(Hepatocellular Carcinomas,HCCs,简称肝癌)是最常见的原发性肝恶性肿瘤的类型之一,它在男性恶性肿瘤中死亡率中位居第二位。大多数非酒精性脂肪肝患者没有明显症状,而大约20%至25%的非酒精性脂肪肝患者会进展为更严重的慢性肝脏炎症性疾病,即非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic Steatohepatitis,NASH),它与肝纤维化、肝硬化和最终形式肝细胞癌相关。越来越多的研究证据表明,久坐不动的生活方式、高脂饮食(High-Fat Diet,HFD)、肥胖和炎症相关代谢性疾病(如胰岛素抵抗和2型糖尿病)与非酒精性脂肪肝发病密切相关。它们可以通过增加肝内游离脂肪酸(Free Fatty Acids,FFAs)分泌,导致肝细胞摄入游离脂肪酸升高,从而引起促炎因子的表达升高。肝细胞脂肪变性和游离脂肪酸表达升高与非酒精性脂肪肝密切相关。游离脂肪酸可分为饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸,其中,饱和脂肪酸包括棕榈酸(Palmitic Acid,PA),不饱和脂肪酸包括油酸(Oleic Acid,OA)。据研究报道,棕榈酸PA,能通过激活c-jun氨基末端激酶2(C-Jun NH2-terminal Kinase,JNK2)在内的一系列机制引发肝细胞的自噬反应,从而引起细胞毒性作用,而油酸OA则不能激活上述反应。Toll样受体4(Toll-like Receptor 4,TLR4)是检测保守的病原相关分子模式(Pathogen-associated Molecular Patterns,PAMPs)和内源性损伤相关分子模式(Endogenous Damage-associated Molecular Patterns,DAMPs)的一种模式识别受体,它具有非常重要的作用。高迁移率族蛋白B1(High-Mobility Group Box 1,HMGB1)是TLR4的配体之一,它是一种广泛表达的非组蛋白核蛋白。研究报道表明,TLR4能够通过调节炎症反应和组织修复,维持组织稳态,从而在NAFLD中发挥重要作用。之前我们的研究报道,肝实质细胞中TLR4/My D88信号通路的调控在高脂饮食诱导的NAFLD早期发展过程中起着举足轻重的作用,其中,从细胞中释放出的HMGB1积极参与了调节TLR4的激活。此外,HMGB1和TLR4还参与肝细胞游离胆固醇脂毒性导致的JNK1介导的线粒体损伤。以上这些研究结果为通过靶向HMGB1治疗NAFLD提供了理论依据,为NAFLD的治疗提供了新的方案和思路。然而,仍然存在一些未解的问题,即是否可能存在除去HMGB1以外的其他DAMPs参与NAFLD的炎症反应和肝损害过程,同时上调与释放HMGB1的上游信号通路和机制仍未解释清楚。此外,NAFLD小鼠模型中内源性HMGB1拮抗剂的治疗作用还需要进一步的研究。本篇文章中我们从体内和体外两个水平,鉴定了在NAFLD背景下,DAMPs相关的TLR4表达谱和HMGB1中和抗体的缓解作用。此外,我们发现HMGB1的表达调控机制同时涉及到转录水平和转录后水平。我们的研究结果为NAFLD的预防和治疗策略提供了新的方法。(二)实验方法1.利用两种游离脂肪酸(棕榈酸PA、油酸OA)处理正常肝细胞系L02及原代肝细胞,利用Real-time PCR和Western Blot等技术研究肝细胞中TLR4及其内源性配体(HMGB1、HSP70、Biglycan、HAS1、HAS2、HAS3)的表达谱改变。2.我们已经建立起成熟的HFD诱导的NAFLD老鼠模型。高脂饲料从上海斯莱克公司定制,饲料成分:2%胆固醇,7%猪油,8.3%卵黄,16.7%蔗糖,66%基础饲料。C57BL/6老鼠从南京模式动物中心订购,老鼠自由进食,每周记录进食量、饮水量、老鼠体重变化。3.运用Real-time PCR、Western Blot和免疫组化技术,从m RNA和蛋白水平系统性的研究NAFLD小鼠模型中肝脏TLR4及其内源性配体的动态变化情况。4.两种游离脂肪酸(棕榈酸PA、油酸OA)处理正常肝细胞系L02及原代肝细胞,利用荧光染色等方法观察细胞坏死、凋亡的变化情况,通过Western Blot和ELISA技术检测细胞培养上清中HMGB1表达的改变。5.利用抗氧化剂NAC和Ca2+螯合剂Bapta处理OA/PA孵育的细胞,荧光染色方法观察细胞坏死、凋亡的变化情况,Western Blot和ELISA方法观察细胞培养上清中HMGB1表达的改变。6.运用Real-time PCR技术研究HFD诱导的C57BL/6NAFLD小鼠肝脏中炎症因子、趋化因子(IL-6、TNF-α、i NOS、SOCS3、MCP-1、MIP-2)表达谱随时间的改变。7.利用HMGB1的混合免疫原(包括1-215位氨基酸和8-215位氨基酸),我们前期已经制备了针对HMGB1的单克隆封闭性抗体,并通过效应验证确认了其特异性、敏感性。8.HFD喂养的C57BL/6小鼠腹腔内注射HMGB1封闭性抗体,在处理的不同时间点观察封闭HMGB1对于NAFLD的影响:检测血清中ALT、AST表达水平的改变;运用Real-time PCR技术检测肝脏中炎症因子、趋化因子表达的改变;运用免疫组化技术检测肝脏中巨噬细胞浸润情况的改变;MPO法检测肝脏中性粒细胞浸润情况的改变;运用油红O染色法检测肝脏脂肪储积的改变。(三)结果1.我们发现NAFLD不同阶段的TLR4内源性配体表达谱不同,在早期阶段(2周),HMGB1是最先表达升高的内源性配体,提示HMGB1可能是激活TLR4最早的因子。2.我们用游离脂肪酸OA/PA处理正常肝细胞系L02,发现PA以及OA刺激均能使细胞内TLR4内源性配体HMGB1表达升高,并且PA可能比OA更快地诱导细胞内HMGB1的表达升高并分泌出来,这种趋势呈现时间、剂量依赖性。3.在体内水平,我们发现高脂饮食喂养的C57BL/6小鼠其肝脏中的HMGB1从2周开始表达显著升高,高脂饮食喂养8周、12周后,肝脏中的HMGB1表达的升高趋势减缓,而此时免疫组化及ELISA检测显示细胞释放的HMGB1显著增加,提示在NAFLD后期,升高的HMGB1可能大量释放出来进入胞周流体或循环中。4.利用HMGB1封闭性抗体封闭HMGB1的作用后,在4周时,P65入核显著减少,提示受HMGB1活化的TLR4信号转导通路活性受到了抑制。5.在处理12周时,与HFD组相比较,HFD+Ab-HMGB1组老鼠肝脏中IL-6、TNF-α、i NOS、SOCS3、MCP-1、IP-10、MIP-2等因子的表达水平均下降,提示HMGB1封闭性抗体能够有效地抑制HFD引起的肝脏炎症基因的表达升高。6.与HFD组相比较,在处理的每一个时间点(2周、4周、8周和12周),HFD+Ab-HMGB1组老鼠肝脏中巨噬细胞浸润均明显减少,提示HMGB1封闭性抗体能够有效地抑制HFD引起的肝脏炎症细胞的浸润。7.与HFD组相比较,在处理的每一个时间点,HFD+Ab-HMGB1组老鼠肝脏中脂肪的储存没有显著改变,提示HMGB1封闭性抗体没有改变单纯脂肪堆积。8.在12周时,与HFD组相比较,HFD+Ab-HMGB1组老鼠肝脏中ACC与SREBP1的表达并没有显著升高,提示HMGB1封闭性抗体没有引起脂肪代谢相关基因的改变。9.与HFD组相比较,在处理的每一个时间点(2周、4周、8周、12周),HFD+Ab-HMGB1组老鼠血清中ALT、AST表达水平没有显著改变,提示HMGB1封闭性抗体不能改变由HFD导致的肝功能损伤。10.棕榈酸PA处理6小时、12小时及24小时能够诱导L02细胞内磷酸化JNK1/JNK2表达显著升高,而总JNK没有明显改变,同时,伴随着HMGB1的表达升高及分泌,提示游离脂肪酸诱导的JNK信号转导通路活化可能是诱导肝细胞内HMGB1表达升高及释放的原因之一。11.JNK抑制剂SP600125能够显著抑制由棕榈酸PA引起的细胞内HMGB1的升高表达以及释放。12.PA能够诱导JNK1/JNK2下游转录因子ATF2的入核以及结合到HMGB1的启动子区,提示PA-JNK1/JNK2-ATF2途径可能从转录水平对HMGB1的调控。13.在C57BL/6老鼠模型中,与ND喂养的相比,HFD喂养的老鼠肝脏中miR-200b-3p/200a-3p/429的表达均随着时间呈现下降趋势。14.在体外实验中,PA处理的L02细胞内的miR-200b-3p/200a-3p/429表达也是下降的。15.miR-200b-3p/200a-3p/429均能够Pull-down HMGB1 3’UTR的序列,并且序列中包含生物信息学分析的结合位点。16.miR-200b-3p/200a-3p/429均能有效降低HMGB1 3’UTR双报告基因活性。异位表达miR-200b-3p/200a-3p/429,也能够在m RNA及蛋白水平降低HMGB1的表达。17.异位表达miR-200b-3p/200a-3p/429,也能够降低磷酸化的JNK1/JNK2的活性,提示HMGB1表达的降低,也许能够通过TLR4信号转导通路的活性降低,从而影响JNK通路的活化。(四)结论我们的发现在非酒精性脂肪性肝病早期阶段,肝细胞内的TLR4内源性配体HMGB1表达升高并且分泌出去,促进了肝脏的炎症反应,通过中和性抗体封闭HMGB1的作用,能够有效的缓解由非酒精性脂肪肝导致的肝脏炎症。HMGB1的表达升高可能受到转录和转录后两个水平的调节。更重要的是,升高表达及分泌出胞外的HMGB1能够活化TLR4信号转导通路,一方面通过NF-KB途径促进炎症因子的释放,另一方面促进了JNK1/JNK2的活化,以正反馈循环的形式促进了HMGB1的表达。围绕HMGB1的多重调控,可能是非酒精性脂肪性肝病早期阶段的重要的分子事件。