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背景与研究目的超极化激活环核苷酸门控阳离子通道（Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels,HCN）属于电压门控型离子通道超家族,具有独特的生物物理学特性。哺乳动物中该通道有四种亚型（HCN1-HCN4）,广泛分布于心脏和神经系统,并介导重要的生理功能。其功能异常与系列心脏和神经兴奋性失调疾病的发生密切相关,如炎性痛或神经病理性疼痛、心律失常和癫痫等。HCN通道被认为可作为治疗上述疾病的新型药物靶点。黄酮类化合物广泛存在于植物源食物中,具有抗炎、镇痛、心血管保护、癌症预防、抗氧化和抗菌抗病毒等众多生理活性。本论文第一部分研究了系列天然黄酮类化合物对HCN通道的功能调控,进一步探讨黄酮类化合物的作用机制,以期作为HCN通道的新型抑制剂并为药物设计提供新的结构框架参考。方法与结果采用全细胞膜片钳,我们检测了 100 μM的12个黄酮类化合物分别对异源表达于COS-7细胞的HCN通道电流的调控。黄酮类化合物有黄酮类（黄芩素、黄芩苷、芹菜素、白杨素）、黄酮醇类（槲皮素、芦丁、杨梅素、淫羊藿苷）、异黄酮类（染料木素、大豆苷元、葛根素）、二氢黄酮类（柚皮素）,在此剂量水平下,我们发现槲皮素和染料木素对HCN通道具有明显的抑制作用。槲皮素对HCN通道三个亚型HCN1、HCN2、HCN4具有不同程度的抑制效果,槲皮素抑制HCN2的IC50为27.32±1.19 μM,而对HCN1和HCN4通道的IC50为66.99±1.32 μM和65.33±1.26 μM。进一步探讨黄酮类化合物的作用机制,发现槲皮素可显著左移HCN通道的电压激活曲线,对HCN通道的调控具有电压依赖性,对通道的关闭具有明显的延迟效应,同时也可减慢通道的开放,且作用不依赖CNBD区。结论我们的研究结果发现一种天然的黄酮类化合物槲皮素对于HCN通道三个亚型HCN1、HCN2、HCN4具有不同的抑制活性,其中对于HCN2通道具有一定的优势抑制效应。槲皮素可作为HCN2通道的负性调节剂。背景与研究目的体积调控型阴离子通道（Volume regulated anion channel,VRAC）在细胞肿胀时开放,主要通透Cl,也可部分通透谷氨酸和牛磺酸等,对细胞的调节性体积回缩（Regulatory Volume Decrease;RVD）至关重要。VRAC被认为在细胞体积调控、增殖、凋亡以及迀移等过程中发挥关键的作用。然而,由于该通道的分子机制一直不得而知,因此,VRAC通道可能具有的生理功能均缺乏直接证据。该通道的分子机制于2014年被揭示,由LRRC8家族异聚构成（LRRC8A-E）。LRRC8A为组成VRAC通道的必要亚基,但LRRC8A必须与LRRC8B-E成员之一异聚化才可形成有功能的通道。生理情况下,RVD是细胞增殖和迁移过程中的必要环节。另外,细胞凋亡,会发生凋亡性体积缩小（Apoptotic Volume Regulation,AVD）,形成凋亡小体。在这些过程中,均发现VRAC通道的开放,调控RVD和AVD的过程。肿瘤细胞表现为显著的持续增殖和凋亡抑制等,因此,我们以肺癌细胞系为例,拟探讨VRAC通道对肺癌细胞的增殖和周期的影响。方法本章节我们主要通过siRNA沉默LRRC8A和LRRC8D的方法,探索其对VRAC通道功能的影响,并研究上述基因被敲低后,肺癌细胞的活力、细胞凋亡和周期分布的变化。本章节主要完成了以下工作:包括,qPCR检测肺癌细胞（A549,H3122,H460,HCC78）中LRRC8各基因的表达;膜片钳检测肺癌细胞中的VRAC通道功能及敲低LRRC8A和LRRC8D对该通道的贡献;进而采用siRNA敲低LRRC8A和LRRC8D以探索VRAC通道对肺癌细胞系活力、凋亡以及细胞周期分布等的影响。实验结果（1） qPCR结果显示,在检测的4株肺癌细胞系中,LRRC8A-E各基因均有表达。其中,LRRC8D相较其他亚型表达最高,LRRC8E则最低。（2）电生理检测敲低LRRC8A后,VRAC电流显著降低,结果表明在肺癌细胞系中,LRRC8A为VRAC通道的必要亚基。沉默LRRC8D后,VRAC通道功能与野生型相比,并无明显变化。（3）集中探讨敲低LRRC8A或LRRC8D后,对A549的细胞活力、细胞凋亡和周期分布的影响:1)有趣的是,CCK8结果表明,沉默LRRC8D后,细胞活力显著下降;而沉默LRRC8A后对细胞活力影响较小。2)流式细胞技术检测对细胞凋亡的影响。结果显示,敲低LRRC8D之后,A549细胞凋亡比例明显增多,增髙近2倍。其中,沉默LRRC8D后早期凋亡和晚期凋亡的细胞比例均显著增多。而沉默LRRC8A后,细胞早期凋亡有一定程度的增高。3)检测对细胞周期的影响。结果表明,敲低LRRC8D后G2/M期的细胞群明显增多,GO/G1期的细胞群相对减少,即细胞主要被阻滞在G2/M期,而敲低LRRC8A后,未观察到细胞周期发生明显的变化。结论综上所述,我们本章节以肺癌细胞系为例,主要探索了LRRC8A和LRRC8D对细胞增殖和细胞周期的重要性。有趣的是,我们发现下调对VRAC电流无影响的LRRC8D可显著抑制A549的细胞活力,而下调VRAC通道的必要亚基LRRC8A却对细胞活力影响并不明显。沉默LRRC8D后,细胞数量和存活率均显著下降,促进细胞凋亡,影响周期的分布和抑制细胞增殖。上述这些结果表明了LRRC8D参与细胞凋亡和细胞增殖等过程,并发挥重要作用,而其作用机制有待后续进一步探讨。