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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是一种以后备母猪流产以及新生仔猪严重肺炎为特征的重要传染病,致病病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),是一种正链RNA病毒。非结构蛋白2(NSP2)是PRRSV最大的非结构蛋白,可分为四个功能区,中间的高变区是富含B细胞表位的区域,有研究表明缺失高变区的部分B细胞表位对PRRSV的复制能力并无影响,因而,可以通过缺失这些区域制备表位缺失标记病毒疫苗,为PRRSV感染动物与免疫动物鉴别诊断提供依据。本研究表达了两种PRRSV GSWW毒株的NSP2主要抗原表位区蛋白,以其中一种纯化的重组蛋白为抗原,初步建立了检测PRRSV血清抗体的间接ELISA方法;并利用另一种分子量较大的表达蛋白研制NSP2单克隆抗体,为建立表位缺失标记病毒疫苗的配套诊断方法奠定基础。以克隆获得的PRRSV/GSWW/15毒株的NSP2基因为模板,设计特异性PCR扩增引物,扩增获得750 bp的NSP2第2010-2759 bp区域(命名为EF2),将EF2片段亚克隆入pET-28a表达载体;同时,委托公司合成了NSP2第2226-3110 bp片段(命名为GD2),并将其亚克隆入表达载体pET-30a,重组表达载体转化大肠杆菌,分别表达获得了大小为29 ku、47 ku的EF2和GD2重组蛋白;免疫印迹结果证实表达的蛋白能被PRRSV阳性血清识别,具有良好的反应活性。以纯化复性后的EF2重组蛋白包被酶标板,初步建立了检测PRRSV NSP2抗体的间接ELISA方法,该间接ELISA方法的主要参数为最佳抗原包被浓度1μɡ/mL,最佳血清稀释度1∶20,兔抗猪IgG酶标二抗体稀释度1∶2000。通过检测30份健康猪血清,确定了间接ELISA方法的判定标准为:S/P>0.17,为PRRSV NSP2抗体阳性;S/P≤0.17,为PRRSV阴性。以此判定标准,检测猪瘟病毒阳性血清、猪伪狂犬病毒阳性血清、口蹄疫病毒阳性血清各1份均为阴性,检测30份PRRSV非免疫健康猪血清,均为阴性;检测133份PRRSV感染后PPRSV猪血清,敏感性为88.7%,表明该方法具有良好的特异性与敏感性。方法重复性检测,批内变异系数为3.8%~6.8%;批间变异系数为4%~8.6%,具有很好的重复性。与法国LSI商品化试剂盒对比,符合率为73.1%;与北京世纪元亨试剂盒相比,符合率为77.2%。结果表明,所建立的ELISA方法可用做PRRSV抗体的临床检测。利用表达纯化的GD2蛋白免疫小鼠,制备了9株NSP2的单克隆抗体,叠加ELISA试验证明,9株单抗识别NSP2蛋白4个不同的抗原表位。选择针对4个表位的效价最高的4株单抗杂交瘤制备了腹水抗体,免疫印迹试验证明,4株单抗均可特异性识别EF2和GD2重组蛋白,这为建立基于单克隆抗体的ELISA抗体检测方法奠定了基础。