研究背景 鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)又称“广东瘤”，是我国常见的恶性肿瘤之一。目前NPC主要的治疗手段是放射治疗，随着放射治疗技术的不断提高和放化疗的综合应用，NPC的5年生存率仍徘徊于50﹪～60﹪。由此可见，NPC临床上需探讨新的治疗模式以改善其5年生存率。近年来，随着对NPC等多种肿瘤发病机制及细胞生长调控机理研究的深入，研究者提出将基因治疗与其它传统抗癌策略如放射治疗、化学治疗、免疫治疗等相结合，希望获得增强或协同的抗癌作用，其中自杀基因系统与放射治疗联合在多种实体瘤的治疗上是较有前景的一种方案。但目前的自杀基因系统大多是直接针对肿瘤细胞的治疗方式。 已有研究表明VEGF及KDR在NPC组织中高表达，且与NPC肿瘤血管的形成呈正相关。体内、外实验均已证实KDR启动子调控的自杀基因可在NPC血管内皮细胞内表达并具有靶向杀伤NPC血管的能力。因此，放射联合靶向NPC微血管内皮细胞自杀基因系统(AdKDR-tk/GCV system)治疗能否改善并提高NPC的局控率和生存率值得探讨。研究目的将由腺病毒(Adenovirus)载体介导的、KDR基因启动子调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(herpes simplex virus-thymidine kinase，HSV-tk)表达的自杀基因系统(AdKDR-tk/GCV System)转入荷瘤裸鼠的人NPC移植瘤内，同时联合<60>Co γ射线肿瘤局部外照射，评价外照射和AdKDR-tk/GCV自杀基因系统对NPC是否具有协同杀伤作用以及作用的大小，为NPC的临床治疗提供新思路和方法。 材料和方法 1细胞培养 1．1细胞株人鼻咽癌CNE-2细胞株。 1．2实验材料RPMI 1640培养基、超净工作台、78-1型电热恒温培养箱等。 1．3实验方法将CNE-2人鼻咽低分化鳞癌细胞株置于10﹪小牛血清的“RPMI”1640培养基培养，并于培养液中加入青霉素100 U/ml，链霉素100mg/ml。传代一周，待细胞长成满瓶时，用0.25﹪胰蛋白酶和0.02﹪。EDTA(乙二胺四乙酸)，按1：1混合配成消化液，制成每毫升含5×10<6>个细胞悬液。 2重组腺病毒构建(由北京大学深圳医院李宝金博士构建)2．1实验材料pBluescript ⅡKDR-tk、穿梭质粒ptrack、腺病毒质粒pAdEasy-1及胚胎肾细胞系293细胞等。 2．2实验方法采用pAdeasy系统，按定向克隆方法将KDR-tk片段正向插入表达载体的多克隆位点间，构建受KDR启动子调控并可表达HSV-tk基因的pAdKDR-tk，在293细胞中包装、扩增。 3裸鼠鼻咽癌移植瘤模型的建立3．1实验动物BALB/C近交系裸鼠32只，雌雄各半，4-6周龄，体重15-20克。 3．2实验材料1ml医用注射器和裸鼠饲养房等。 3．3实验方法将含1×10<6>个(0.2 ml)CNE-2细胞的悬液注射到裸鼠背侧右后肢上部皮下后，于中山大学动物实验中心二级以上动物实验室饲养，并定期观察记录移植瘤生长情况。 4动物分组和治疗4．1实验材料重组腺病毒系统(AdKDR-tk system)、丙氧鸟苷(g8nciclovir， GCV)、780C型<60>Co机等。 4．2实验方法4．2．1动物分组CNE-2细胞接种结束后第14天时，全部成瘤，大小约200ram<3>，将裸鼠随机分为4组，每组8只，分别为自杀基因联合放射治疗组(Ⅰ组：AdKDR-tk+GCV+Radiation)、放射治疗组(Ⅱ组：Radiation+PBS)、自杀基因治疗组 (Ⅲ组：AdKDR-tk+GCV)和空白对照组(Ⅳ组：AdKDR-tk+PBS)。 4．2．2治疗分别对Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组裸鼠瘤体内进行多点注射重组腺病毒液共0.2m1，此后24小时和第7天各重复注射一次重组腺病毒液。第二次注射病毒液时，同时向Ⅰ、Ⅲ组小鼠腹腔注射GCV 100 mg/kg，Ⅱ、Ⅳ组小鼠腹腔注射PBS100mg/kg，每日一次，连续14天。其中Ⅰ、Ⅱ组小鼠分别于腹腔注射GCV和PBS后12小时以水合氯醛300mg/kg腹腔内注射，麻醉后施行<60>Co γ射线局部外照射裸鼠移植瘤(1 cm宽条形放射野照射瘤体)，225伦琴/分钟，2Gy/次，隔日外照射一次，共7次，外照射总剂量14Gy。 4．2．3动态观察记录裸鼠移植瘤生长大小治疗前l天及治疗开始后的第3天，第6天，第9天，第12天，第15天，第18天及第21天测量瘤体垂直长径和短径，绘制瘤体生长曲线。 4．2．4处死裸鼠、剥离肿瘤并测量实体瘤质量治疗结束后第8天处死裸鼠，剥离瘤块并称重，计算各组的肿瘤质量抑制率。 4．2．5取材、收集标本肿瘤称重结束后将其浸泡于4﹪多聚甲醛中固定，保存标本备用。 5常规病理学检查5．1实验材料苏木素、伊红、乙醇、二甲苯、OLYMPUS光学显微镜、真空干燥箱、组织切片机等。 5．2实验方法采用切片、脱蜡、苏木素、伊红染色及脱水步骤。 6免疫组化染色6．1实验材料鼠抗人CD34单克隆抗体、B10TINYLATED-GOAl、IgG(H+L)、亲合素-过氧化酶复合物、电子天平、真空干燥箱、微量可调移液器、微波炉等。 6．2实验方法6．2．1免疫组化采用ABC法步骤采用切片、脱蜡、抗原修复、滴加一抗、二抗及亲合素-过氧化酶复合物和复染苏木素步骤。 6．2．2免疫组化CD34结果判定分别于低倍镜(×40)和高倍镜(20×10)下按 weidner方法计数肿瘤微血管密度(Microvessel density，MVD)。 7 统计学方法实验结果采用采用SPSS 11.0统计学软件，瘤体体积、质量及MVD值均以x±S表示，组问均数比较采用t检验进行分析。 结果 1 pBluescript Ⅱ KDR-tk鉴定经Xho Ⅰ/Sal Ⅰ酶切后，显示为两条片段，分别为2.2kb和2.96kb，大小及测序结果与提供资料相符。 2重组腺病毒质粒pAdKDR-tk鉴定重组pAdKDR-tk经Pac Ⅰ酶切，显示的2个片段大小与预期值(4.5kb和37kb)一致。 3重组腺病毒的产生及滴度测定重组腺病毒质粒转染293细胞后，荧光显微镜下可见细胞有GFP表达。经3次293细胞内的扩增、CsCl梯度离心后，测定病毒滴度为1×10<10>pfu/ml。 4重组腺病毒的鉴定PCR分析外源基因的整合按标准方法抽提病毒基因组DNA，取1 μl进行PCR，结果表明病毒载体介导tk基因整合至重组腺病毒基因组中。 RT-PCR分析外源基因的表达采用TRIzol试剂盒，抽提293细胞总RNA，进行RT-PCP反应，可见扩增的片段，表明tk基因在mRNA水平上能有效的表达。 5裸鼠人NPC移植瘤生长曲线癌细胞系接种在BALB/C裸鼠两周全部成瘤。治疗前各组肿瘤体积差异无统计学意义(P>0.05)；经治疗后第3天起小鼠瘤体体积发生变化，Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ组裸鼠移植瘤体积小于Ⅳ组裸鼠肿瘤体积，差异具有统计学意义(P<0.01)；第6天前，Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ组问裸鼠肿瘤大小无显著差异性(P>0.05)；从第9天起，Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ组间肿瘤体积大小由大到小依次为Ⅲ组、Ⅱ组和Ⅰ组，差异具有统计学意义(P<0.05)。 6肿瘤质量抑制率结果显示Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组的肿瘤质量小于Ⅳ组肿瘤质量，差异均有统计学意义(P<0.01)，且Ⅰ组的肿瘤质量抑制率为84.39﹪，高于Ⅱ、Ⅲ组的70.88﹪和58.43﹪，差异具有统计学意义(P<0.05)，Ⅱ组肿瘤质量抑制率高于Ⅲ组，差异亦具有统计学意义(P<0.05)，初步实验证实：综合治疗组明显优于单纯放疗或自杀基因治疗组。 7常规病理检查结果空白对照组癌细胞体积大，呈圆形、卵圆形或不规则形，胞浆界限不清，细胞呈团块状或片巢状不规则排列，可见泡状核，部分细胞见明显核仁。放射治疗联合自杀基因治疗组NPC细胞数目较单一放疗组、单纯自杀基因治疗组和空白对照组NPC细胞数目减少，癌细胞呈退行性变，见大量核碎裂。 8免疫组化CD34微血管计数结果CD34．阳性表达呈棕黄色或棕褐色颗粒状，表达于血管内皮细胞膜中。治疗结束后空白对照组及治疗组免疫组化染色均可见肿瘤间质内染成棕褐色单个内皮细胞和/或内皮细胞簇的微血管。 结论 1．利用腺病毒载体转染HSV-tk基因联合放射治疗BALB/C近交系荷人NPC裸鼠可明显抑制瘤体生长，且抑制程度优于单一放疗或自杀基因治疗组(P<0.05)，治疗后肿瘤质量抑制率高于单一放疗或自杀基因治疗组(P<0.05)。 2．免疫组化CD34微血管计数显示联合治疗组MVD平均值为2.73±0.30，小于单一放疗组或自杀基因治疗组，在抑制肿瘤血管生成方面优于单一放疗或自杀基因治疗组(P<0.05)。 3．靶向肿瘤血管的自杀基因系统联合放射治疗BALB/C近交系荷人NPC裸鼠较单一放疗或自杀基因治疗方案有显著的提高，差异有统计学意义(P<0.05)，本研究为进一步开展靶向肿瘤血管内皮细胞自杀基因联合放射治疗NPC奠定了良好的理论和临床基础。